稻瘟病是由真菌 Magnaporthe oryzae 感染引起，严重威胁水稻产量，甚至可能导致绝产。如何让作物获得广谱抗病性，是植物与病原菌间的“军备竞赛”。在植物与病原菌互作中，植物建立了两层免疫防卫体系，即病原相关分子模式激发的基础免疫反应（PTI）和效应蛋白激发的特异性免疫反应（ETI），两者能够协调并共同作用促进防御代谢物产生并对抗病原体，然而它们具体如何协调，并激发广谱抗性仍有待探究。
2021年12月16日，国际顶尖期刊Nature（IF 49.962）在线发表了中国科学院分子植物科学卓越创新中心何祖华等研究组，题为 “NLRs guard metabolism to coordinate pattern- and effector-triggered immunity” 的论文，揭示了一条全新广谱免疫代谢调控通路：PICI1—OsMETS—蛋氨酸—乙烯通路，并证明水稻广谱抗病蛋白NLR受体调控该代谢通路保护植物，协同整合PTI和ETI，赋予水稻广谱抗病性的新策略，为农作物抗病育种设计奠定理论基础。其中，中科新生命提供了TMT蛋白质组、泛素化蛋白鉴定服务。 研究材料 水稻（目标基因敲除或过表达的转基因水稻） 技术路线 · 步骤1：蛋白质组及蛋白互作分析筛选广谱抗性NLR蛋白的关键作用因子； · 步骤2：PICI1在ETI和PTI中发挥功能； · 步骤3：PICI1通过去泛素化作用稳定OsMETS； · 步骤4：OsMETS稳定积累增强了蛋氨酸-乙烯生物合成并提高抗瘟性； · 步骤5：PigmR保护PICI1不被AvrPi9降解，PICI1的自然变异有助于亚种免疫分化。 1. 蛋白质组及蛋白互作分析筛选广谱抗性NLR蛋白的关键作用因子 以往研究发现，水稻NLR受体蛋白PigmR具有广谱抗稻瘟病能力，表明其可能整合了PTI和ETI两种途径以保证其广谱抗性。为识别关键调控因子，首先通过TMT定量蛋白质组，筛选Chitin诱导植物免疫后的关键差异蛋白（与PTI相关）；随后通过酵母双杂(Y2H)，筛选与PigmR受体相互作用的蛋白。结合两者筛选结果，获得交集的候选蛋白称为PICIs （PigmR互作及chitin诱导蛋白)，并进行后续深入研究。
图1 关键免疫调控因子PICIs的筛选
2. PICI1在ETI和PTI中发挥功能 进一步，通过免疫共沉淀及共定位等实验，确认了PICI1与PigmR相互作用。随后，在野生型近等基因Pigm株系(nili -Pigm)中构建PICI1基因敲除株系、PICI1基因过表达株系（PICI1- OE），发现较野生型和过表达株系相比，敲除株系（PICI1- KO）的抗病性显著降低。接下来，进一步分析PICI1在PTI中的作用，发现Chitin可诱导PICI1表达，且在PICI1敲除株系（PICI1-KO）中，Chitin诱导的活性氧产生和病原体相关疾病表达被抑制，而在PICI1过表达株系中（PICI1-OE）得以增强。综上表明，PICI1与PigmR相互作用，并介导ETI和PTI反应。
图2 PICI1通过与PigmR相互作用，参与PigmR介导抗病性与PTI反应
3. PICI1通过去泛素化作用稳定OsMETS 随后蛋白序列结构域分析及实验确认，表明PICI1是一种去泛素化酶。为鉴定其底物，进行了PICI1的免疫共沉淀及质谱分析（IP-MS）将得到的互作蛋白与Chitin诱导的泛素化变化蛋白相交，筛选到20个泛素化候选蛋白，其中包括一个在单子叶和双子叶中高度保守的蛋氨酸（Met）合酶(LOC_Os12g42876)。结合体外及体内等一系列实验，发现PICI1存在时OsMETS1-Flag稳定积累，综上说明OsMETS1是PICI1的底物，PICI1通过去泛素化作用稳定OsMETS。
图3 PICI1是去泛素化酶，通过去泛素化作用稳定OsMETS
4. OsMETS稳定积累增强了蛋氨酸-乙烯生物合成并提高抗瘟性 随后探究了OsMETS的抗病功能，确认了Chitin或flg22处理引发OsMETS表达积累，蛋氨酸（Met）介导免疫作用可通过诱导病原体相关基因观察到剂量依赖的Met介导的抗瘟性。综上表明，OsMETs介导的的生物合成，并在抗稻瘟病中发挥了重要作用。由于Met是乙烯在植物免疫中的前体，用Met处理能增加乙烯的产量，故进一步分析OsMETs是否通过提高乙烯合成发挥作用。实验表明，采用ACC(乙烯前驱体)预处理增加了抗瘟性，而AVG(乙烯生物合成抑制剂) 预处理降低了抗瘟性。总之，OsMETS稳定积累增强了蛋氨酸-乙烯生物合成并提高抗瘟性。
图4 OsMETS稳定积累增强了蛋氨酸-乙烯生物合成并提高抗瘟性
5. PigmR保护PICI1不被AvrPi9降解，PICI1的自然变异有助于亚种免疫分化 由于水稻在与病原菌长期处于类似于“军备竞赛”的协同进化中，通过PICI1互作分析找到了病原菌分泌的毒性蛋白（AvrPi9），其能通过降解PICI1，抑制水稻的基础抗病性（PTI），以有利于病原菌的入侵。然而，水稻进化产生的广谱抗病NLR受体可以通过抑制病原菌毒性蛋白与PICI1的互作，保护并加强PICI1的功能，进而激活更多的防卫化学物质（蛋氨酸—乙烯）的合成，以获得广谱抗病性。 最后，对3000份水稻品种的基因组数据分析发现，PICI1启动子具有籼粳分化的自然变异位点，与水稻对稻瘟病的田间抗性紧密关联，从而为水稻抗病育种提供了新的靶点。 小编小结 本研究综合利用蛋白质组学、植物病理、分子遗传等策略，鉴定到一条新的植物免疫代谢通路：PICI1—OsMETS—蛋氨酸—乙烯。证明去泛素化酶PICI1作为一个新的免疫调控蛋白，通过增强蛋氨酸合酶OsMETS的稳定性，促进蛋氨酸介导乙烯代谢通路，参与水稻对抗病原菌的过程中，并且证明该途径是植物协同整合PTI和ETI两层免疫系统的重要策略之一，为水稻抗病育种提供新策略。
值得一提的是，文中几处关键因子的筛选利用了基于质谱组学结果，如蛋白质组学、泛素化等，说明组学技术是筛选关键调控蛋白的重要方法之一。中科新生命能够提供蛋白质组、修饰蛋白质组等多种组学检测服务，欢迎感兴趣的老师前来咨询。 中科优品推荐 【中科新生命】提供蛋白质组、修饰蛋白质组等多种组学检测服务，作为前中科院上海生科院蛋白质研究分析中心，具有超17年项目经验积累，提供最完整、最可靠的组学技术服务，创新引领前沿技术发展。欢迎感兴趣地老师前来咨询。
研究结果
图5 PigmR保护PICI1不被AvrPi9降解，PICI1自然变异有助于亚种免疫
