这篇推文之前推过，读者提出了一些问题，重新修改了再次发出。
单克隆抗体技术日新月异，比如，单B技术啊,噬菌体展示库技术，但是小鼠杂交瘤技术因其简单易操，便于实施，目前还是单抗研发的主流技术。
筛选到阳性细胞株后，传统的生产单克隆抗体方法是将单克隆细胞株扩繁之后，注入Balb/c小鼠腹腔内产生腹水，最后从腹水中纯化得到单克隆抗体。这种生产单克隆抗体方法有很多弊端：1.周期长，通常需要三到四周左右的时间，细胞扩繁到可以注射到小鼠体内（每只小鼠需要10^5个细胞）通常需要3~5个天，细胞生长至小鼠腹腔内产生腹水通常需要1~2周，何况有的细胞株在小鼠体内形成实体瘤，根本就不产腹水；2.腹腔注射腹水法需要使用大量的Balb/c小鼠，在其体内注射瘤细胞，有点残忍，不符合动物福利。3.腹腔内腹水法生产单克隆抗体，受动物个体影响也很大，另外，最终纯化得到的抗体含有动物源蛋白成份污染的可能。
为什么要把细胞株驯化成无血清培养呢，直接用现有含血清培养基放大培养产抗体不行么？含牛血清的细胞培养上清里面含有大量的牛免疫球蛋白，会干扰从细胞培养液上清纯化单克隆抗体，其抗体产量也不高。无血清培养基在摇瓶中培养经过驯化的细胞，密度可以达到10^7/ml以上甚至达到10^8/ml，抗体产量自然大大提高，抗体下游纯化不受动物成分干扰。
多年以来我一直在苦苦求索合适的杂交瘤无血清培养基产品。2018年，我问过几个做培养基的朋友，他们说目前生产的杂交瘤培养基，还是需要加入少量的血清，还没办法做到完全的无血清。
曾经也求助于做过小鼠杂交瘤细胞无血清驯化的朋友，他给了我一瓶北京某公司生产的杂交瘤细胞无血清培养基让我自己试，并且告诉我在他们的实验数据中，有很多细胞珠在驯化的最后一步断血清的时候还是会死掉的。我把这个培养基拿回来测试了一下，正如他所说的那样，每次培养到血清0.5%的时候，细胞就开始死亡了。
不到黄河不死心，一旦有这方面的信息，我还是想再试试。于是又从北京和上海的两个厂家购买了杂交瘤无血清培养基回来测试，每次都是到了血清0.5%的时候，细胞就开始死亡了。
杂交瘤细胞无血清驯化这事只能搁浅，但始终是一个疙瘩埋在我的心里。
今年3月份，在苏州的一个展会上认识了珠海凯瑞杨经理，他们是做无血清培养基的，在展会现场，我们并没有谈及此事，只记得好像很久以前买过他们的293培养基。8月初，苏州的思格生物任总和恺瑞杨经理来武汉出差，有机会向任总请教了杂交瘤无血清驯化的问题。任总的不吝赐教，让我再次燃起了杂交瘤细胞无血清驯化的希望。任总告诉我，他们所用的杂交流无血清培养基是恺瑞的。
8月份，我们手上正好有几株在养的杂交瘤细胞株。于是我就向杨经理申请了试用装。对于感兴趣的产品，如果厂家没有试用装，自掏腰包购买我也愿意尝试。一个企业生产流程的建立，原料的来源和筛选是其中最重要的一环，好的产品是在帮你。有时候，我倒是有点憎恶那种到处要试用装的人，有的拿了试用装，往冰箱一扔，根本不测试；或者，测试了之后，他的实验也做完了，压根懒得理你。
拿到培养基试用装，我立即选了几株杂交瘤细胞开始了驯化实验测试。
根据任总给的驯化流程，我选择在24孔板里驯化，并稍微修改了驯化流程：将杂交瘤细胞培养至24孔板内，细胞贴壁后，驯化过程基本步骤如下：细胞培养孔中置换为无血清培养基（含1% 100X ITSplus 因子和10%胎牛血清）培养，根据细胞生长的速度换液，每次换液将血清减半，依次为10%-5%-2.5%-1.25%-0，最后扩大培养到T75细胞培养瓶，置换新鲜的无血清培养基（含1% 100X ITSplus 因子），按10^6/ml的密度转入摇瓶培养，90rpm。
之前所有的失败案例，我都是在摇瓶中驯化，这次任总特意强调，驯化过程要静置培养，摇晃对细胞损伤比较大，我之前的思想误区一直认为摇晃起来让细胞更好地接触到新鲜培养基和空气环境，更利于生长。
这次很幸运，几株细胞都平稳驯化到无血清摇瓶培养状态，整个周期下来一周多时间。
这次驯化虽然是成功了，但是我觉得周期还是有点长。于是我设计了这样一个方案：将原培养基培养的杂交瘤细胞，吹打悬浮离心后，用无血清培养基（含1% 100X ITSplus 因子 ）重悬，分种到24孔板孔内，每孔10^5个细胞，然后再梯度加入血清，使其终浓度依次为10%-5%-2.5%-1.25%-0.5%-0。培养24小时后，保留细胞形态良好，抗体分泌能力正常的，血清含量最低浓度细胞培养孔继续培养稳定传代2次，再按照上述思路继续减少血清驯化，直至驯化到无血清。这个思路的优势是可以快速找到杂交瘤细胞的最低血清耐受点，比之前按部就班减血清的方法更节约时间。这样驯化周期至少可以缩短一半，同时更节约培养基。
以上两种方案都是我们自己琢磨的使用方法，那么生产厂家的标准指导步骤是什么呢？我这个人性子急，拿到产品，不管是产品还是试剂，直接上手就开搞，除非搞不明白了再去扒拉说明书。这一次不同，我们是“自学成才”，再回头看厂家是怎么教我们解锁新技能呢？
我之前也没有在意试用装产品里有没有纸质说明书。于是给杨经理发了微信要了电子版说明书。
这里与任总说的不一样：厂家是建议用摇瓶。另外，已经驯化到别厂家无血清培养基的细胞株，这里是一下子直接适应不过，还是说把它按照有血清培养细胞株对待，用减血清方法驯化不过来呢？
这个驯化过程的说明，这里有点没看明白：划红线第一句话的意思是不是将杂交瘤细胞在原培养基中扩增培养？第二句“用力拍打瓶身”，这个不好把握，用多大的力？我用专业的细胞培养吸管吹起让其悬浮，细胞它难道会跳起来咬人？
驯化到无血清培养基的细胞基本就开始“飘”了，有的成团，像青蛙卵，有的像一粒一粒晶莹剔透的珍珠，细胞形状和大小也不一。手机直接对着显微镜拍的，图像不太好看。
至于抗体的产量，这里就不写了，因为每株细胞产生抗体能力不一样，何况我刚刚开始入手，手上的案例较少，数据没有说服力。
昨天晚上与一个做抗体的吴总吃饭，我推荐他用无血清培养生产单抗，他是抗拒的，一方面他觉得成本高，另一方面，还是担心无血清驯化的过程中细胞株会退化，生产的抗体性能上比腹水法弱。
吴总担心的问题其实是很多做单抗生产的人都担心的问题，上次贾总也担心这个问题。其实，成本嘛，可以跟厂家谈，培养基的生产成本应该不是很高。至于细胞退化的问题，只要定期做好抗体效价监测和抗体验证，应该问题也不大。对于科研用户我是强烈推荐用无血清驯化杂交瘤细胞法生产单克隆抗体，节约时间，科研对于抗体的需求量较少，绝对比小鼠腹腔产腹水法更节约成本。
关于杂交瘤无血清驯化问题，欢迎交流，微信号：frdbio;也欢迎推荐分享更好更质优价廉的无血清培养基。