随着生物技术的飞速发展，mRNA疗法作为一种新兴的治疗手段，因其可编程性强、响应速度快等优势备受关注。在mRNA疫苗和基因治疗等领域中，高效合成高质量的mRNA是实现疗法目标的关键步骤。而在这一过程中，T7 RNA聚合酶扮演着至关重要的角色，它能够高效地催化体外合成mRNA的过程。
尽管T7 RNA聚合酶在mRNA合成中发挥着重要作用，但实际操作中经常会产生双链RNA（dsRNA）这一副产物。dsRNA的存在不仅降低了mRNA的产量和纯度，还可能激发非特异性免疫反应，影响疗效和安全性。因此，减少dsRNA的产生成为了行业的一个迫切需求。
目前，降低dsRNA的方法主要包括优化反应条件和使用辅助酶等。这些方法虽然可以在一定程度上减少dsRNA的产生，但往往伴随着操作复杂、成本提高等问题。与之相比，通过直接改造T7 RNA聚合酶来降低dsRNA的产生则是一种更为根本的解决方案。酶定向改造技术可以通过精确改变酶的氨基酸序列或结构，从而改善其催化特性，提高产物的纯度和产率。对于T7 RNA聚合酶而言，针对性的改造不仅可以减少dsRNA的产生，还能提升合成mRNA的整体效率和质量。
翌圣镁孚泰生物突破性成果
作为mRNA体外合成原料供应商（了解更多），翌圣生物凭借子公司镁孚泰生物的ZymeEditor定向进化平台的能力，持续在进化mRNA体外合成的核心酶原料——T7 RNA聚合酶。为了尽可能消除体外转录过程产生的dsRNA等副产物，镁孚泰生物进化团队通过理性设计与定向筛选结合的方式对T7 RNA聚合酶进行改造。
根据文献报导，副产物dsRNA的产生主要包括两种来源（图1）：第一种是转录早期T7 RNA聚合酶由起始构象转变为延伸构象时，转录三元复合物极易解离[1]，伴随着大量长度在20 nt左右的短RNA链（即Abortive RNA）释放至体系中，这部分RNA即扮演“引物“的角色与长RNA链互补配对，并在T7 RNA聚合酶的RNA依赖的RNA聚合活性（RDRP活性）作用下延伸产生dsRNA[2,3]；第二种则由T7 RNA聚合酶具备的末端核糖核苷转移活性而引发，当转录反应进行到线性模板末端时，T7 RNA聚合酶会在不依赖模板的情况下随机增加若干个核糖核苷酸，这些核苷酸组成的“随机引物”即有可能反向折叠与目标mRNA区域发生互补配对进而延伸产生dsRNA，通过回环产生的dsRNA称为loopback dsRNA[3,4]。因此，为了减少dsRNA副产物，T7 RNA聚合酶改造的重点在于稳定早期转录三元复合物，或减弱T7 RNA聚合酶的末端转移活性和RDRP活性。
在进行T7 RNA 聚合酶改造过程中，镁孚泰生物一方面通过结构及自由能分析，发现在T7 RNA聚合酶构象变化的同时也伴随着能量的变化，且延伸构象的自由能显著高于起始构象，意味着转录过程需要越过较高的能垒才能产生完整的mRNA链。高能垒不利于构象平稳转变，为此，团队借助虚拟筛选手段锁定了20余个热点氨基酸，并构建了相应的定点饱和文库。另一方面，考虑到关于T7 RNA聚合酶的末端转移及RDRP活性相关的功能、位点及结构域的报导较少，且由于功能相近这两种活性极可能与T7 RNA聚合酶主反应的转录活性（即DNA依赖的RNA聚合活性，DDRP）共享关键位点，难以找到热点氨基酸进行定点改造。因此，镁孚泰生物同时构建了基于易错PCR的数个随机突变文库，结合ZymeEditor平台的进化通量，单个文库的多样性超过106。
为了兼顾T7 RNA聚合酶的产量并监测体外转录反应中dsRNA的含量，镁孚泰生物参照优化后的转录模板，精心设计了多个分子信标（FRET RNA探针），分别靶向目标mRNA产物的不同区域，将反应物产量、完整度以及体系内dsRNA含量等信息与荧光信号关联，体系的荧光强度越强，突变体的性能越有优势。理论上，该筛选方法可按不同探针的荧光强度排序，分别获得高产或Abortive RNA减少的T7 RNA聚合酶突变体，以及完整度提升或loopback dsRNA降低的T7 RNA聚合酶突变体。将反应模板更换为RNA时还可负向筛选突变体的RDRP活性，提升T7 RNA聚合酶的模板选择能力。此外，在液滴反应体系中添加修饰核苷酸、帽类似物，以及提高反应温度还可以进一步筛选耐受非天然底物、热稳定性提升的T7 RNA聚合酶突变体。
根据文库大小，镁孚泰生物分别开发了基于荧光激活液滴分选（FADS）的超高通量筛选流程（图2），以及基于传统孔板法（MTPS）的高通量筛选流程（图3）。经过多轮实验，合计筛选超过107个突变体，获得多个dsRNA显著降低的突变体，其中RP051、RP059突变体反应中由Abortive RNA引起的dsRNA降低，提示这些聚合酶突变体的延伸构象更稳定；RP057、RP078突变体反应中loopback dsRNA含量降低，提示这些突变体的末端转移活性或RDRP活性被减弱。
鉴于上述突变体的性能优势来源于不同机制，镁孚泰生物针对它们构建了DNA shuffling文库，筛选后最终获得了性能更优的组合突变体RP080-RP082（图4）。
经过定量分析，如图5所示，在9 kb转录模板、共转录加帽条件下，使用天然核苷酸时，野生型T7 RNA聚合酶产物中dsRNA约为2.9 ng/μg，A公司竞品约0.18 ng/μg。而镁孚泰生物改造的各T7 RNA 聚合酶突变体dsRNA产量均＜0.10 ng/μg，尤其突变体RP082的dsRNA产量仅为0.015 ng/μg，相比于野生型提升近200倍，比竞品提升12倍。经过反复测试，突变体的降低dsRNA的性能优势在不同反应条件下均能稳定复现，表明上述突变体具有较好的体系兼容性，也为后续反应体系优化以进一步降低dsRNA产量奠定了基础。此外，FADS的筛选还获得了多个产物完整度、热稳定性提升的突变体，可满足更多的体外转录应用场景。
客户试用满意度高
目前，已有多家合作伙伴对镁孚泰生物改造的T7 RNA聚合酶突变体进行了试用，得到客户的高度认可。他们表示，新酶的使用简化了mRNA的纯化过程，提高了工作效率，并在多个应用场景中展现出卓越的性能。
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关于镁孚泰
镁孚泰生物科技（上海）有限公司（镁孚泰生物，Molefuture）是翌圣生物科技（上海）股份有限公司旗下的全资子公司，是一家以酶进化技术为驱动、专注于提供酶改造定制化解决方案的创新型企业。依托于翌圣生物，镁孚泰生物现有六大技术平台：ZymeEditor创新酶进化平台、多宿主高效表达平台、发酵工艺开发平台、纯化工艺开发平台、超洁净酶生产平台以及酶分析与质控平台。基于这六大技术平台，镁孚泰生物可提供酶定向改造、新酶开发、酶工艺开发以及GMP级别规模化生产的全套定制解决方案，以满足酶在体外诊断、生物医药、合成生物、医疗美容、医药中间体等领域的应用需求。
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参考文献：
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