临床组织是分子机制研究的首选样本，但COVID-19临床组织很少，且大多来自终末期患者的尸检。动物模型，尤其是非人灵长类动物模型的建立，可为COVID-19相关研究奠定基础。
2022年1月北京协和医学院杨俊涛教授在Signal transduction and targeted therapy（IF 18.187）杂志上发表题目为“Proteomic and phosphoproteomic profiling of COVID-19-associated lung and liver injury: a report based on rhesus macaques”的研究成果，利用蛋白组学和磷酸化蛋白组学首次对感染SARS-CoV-2的恒河猴早期肺组织和肝组织分子变化进行研究，为进一步研究SARS-CoV-2的分子机制和药物发现提供了有效的数据资源。
研究材料：
空白对照组和病毒感染组；SARS-CoV-2感染7天后的恒河猴肺、肝组织（n=8）
技术路线：
步骤1：肺、肝损伤表型分析
步骤2：蛋白组学分析
步骤3：差异蛋白PPI互作
步骤4：磷酸化蛋白组学分析
步骤5：激酶预测
步骤6：激酶与药物整合预测
研究结果：
1. 恒河猴SARS-CoV-2感染后肺、肝损伤检测
采用定量RT-PCR方法检测感染恒河猴鼻、喉、肛门拭子中SARS-CoV-2 RNA含量，确定7天后SARS-CoV-2 病毒含量趋于稳定（图1a）。从胸片可直观看到，病毒感染组恒河猴肺部间质滤过和渗出性病变（图1b）。与对照组相比，感染组恒河猴肺部有多个病理病变和出血点（图1c）。进一步定量RT-PCR检测发现，感染组恒河猴肝脏中的病毒载量低于肺部（图1d）。从病理切片可以看到感染组恒河猴肺部有明显的炎性细胞浸润，肺间隔局部增厚，血管血栓形成；肝脏中肝窦间隙增宽、炎症细胞散在浸润（图1e）。
图1 恒河猴SARS-CoV-2感染及随后肺、肝损伤的验证
2.恒河猴SARS-CoV-2感染后肺、肝组织蛋白组学分析
蛋白质组学定量了肺中6715个蛋白和肝脏中5238个蛋白。主成分分析（PCA）结果显示，对照组和病毒感染组之间肝脏蛋白表达谱的总体差异大于肺（图2b，c）。与对照组相比，感染组肺组织和肝组织差异表达蛋白分别为757个和1219个（图2d）。KEGG通路富集分析显示，在感染组的肺组织中，核糖体、DNA复制、RIG- I样受体或信号通路、错配修复等相关通路蛋白上调；与ECM -受体相互作用关系最为密切蛋白的下调（图2e）。在感染组的肝脏组织中，核糖体、氨基酰基-tRNA生物合成、氧化磷酸化等相关通路蛋白上调；剪接体、调控肌动蛋白细胞骨架和局部粘附等相关蛋白下调（图2f）。
图2 恒河猴SARS-CoV-2感染后肺、肝组织蛋白比较
3.差异蛋白PPI互作分析
将通路富集到的蛋白进行蛋白相互作用（PPI）分析。肺部（图3a）和肝脏（图3b）在感染后均出现代谢相关蛋白和核糖体相关蛋白水平升高。结合KEGG和STRING数据库，发现感染组肺组织RIG-I通路、蛋白加工、DNA复制和修复相关蛋白上调，肝组织氧化呼吸链和蛋白质加工通路相关蛋白发生显著变化。蛋白酶介导的蛋白质降解在肺中活跃，但在肝脏中受到抑制（图3c，d）。同时发现，SARS-CoV-2感染7天后，局灶性粘连周围蛋白呈下降趋势。整合素α家族中的ITGA5和链接ECM和细胞骨架的DAG1在感染肺和肝脏组织中均下降（图3c，d）。
图3 差异蛋白互作分析
4. 恒河猴SARS-CoV-2感染后肺、肝组织磷酸化蛋白组学分析
磷酸化是细胞对刺激做出反应的一种快速调节方法，已在一些SARS-CoV-2感染的细胞模型或尸检样本中检测到。因此，作者分析了恒河猴肺和肝脏的磷酸化蛋白质组，以期找到SARS-CoV-2感染期间的潜在药物靶点。共定量了肺中4185个蛋白质的12,418个磷酸位点和肝脏中3191个蛋白质的8134个磷酸化位点。其中，肺部873个蛋白质的1162个位点和肝脏712个蛋白质中的960个位点差异表达。通路富集和PPI互作分析发现，肺中上调的磷酸化蛋白富集于代谢、剪接体和泛素介导的蛋白水解等途径，而下调磷酸化蛋白与Fc-γ-R介导的吞噬、粘附连接和基础转录因子相关（图4a）。在肝脏中，上调的磷酸化蛋白富集于多种代谢途径，而下调的磷酸化蛋白与基础转录因子、剪接体、RNA转运等相关（图4b）。PPI互作结果显示，上调的磷酸化蛋白多于下调的磷酸化蛋白（图4c，d）。
磷酸化是细胞对刺激做出反应的一种快速调节方法，已在一些SARS-CoV-2感染的细胞模型或尸检样本中检测到。因此，作者分析了恒河猴肺和肝脏的磷酸化蛋白质组，以期找到SARS-CoV-2感染期间的潜在药物靶点。共定量了肺中4185个蛋白质的12,418个磷酸位点和肝脏中3191个蛋白质的8134个磷酸化位点。其中，肺部873个蛋白质的1162个位点和肝脏712个蛋白质中的960个位点差异表达。通路富集和PPI互作分析发现，肺中上调的磷酸化蛋白富集于代谢、剪接体和泛素介导的蛋白水解等途径，而下调磷酸化蛋白与Fc-γ-R介导的吞噬、粘附连接和基础转录因子相关（图4a）。在肝脏中，上调的磷酸化蛋白富集于多种代谢途径，而下调的磷酸化蛋白与基础转录因子、剪接体、RNA转运等相关（图4b）。PPI互作结果显示，上调的磷酸化蛋白多于下调的磷酸化蛋白（图4c，d）。
图4 恒河猴肺、肝中差异磷酸化蛋白KEGG通路富集和PPI分析
5. 恒河猴SARS-CoV-2感染后肺、肝组织激酶预测
为获得更多信息，将恒河猴肺和肝组织磷酸化位点进行激酶预测。在肺中，与炎症（PKR、IKKβ、P38δ和JNK3）、细胞周期（CDK1和CDK2）、增殖（MAP2K1和MAP2K2）和代谢（AKT3、PKCi和AMPKs）相关的激酶被激活，而细胞骨架重组相关激酶MRCKα被抑制（图5a）。在肝脏中，代谢相关的激酶（AMPKs和PKCs）被激活，而炎症相关的激酶（JNK1和JNK2）则处于静止甚至抑制状态（图5b）。在蛋白组和磷酸化蛋白组数据中并没有发现所有的预测激酶（图5c，d），说明激酶预测分析能扩大SARS-CoV-2作用靶点的探索范围。
图5 恒河猴肺和肝中的激酶分析
6. 恒河猴SARS-CoV-2感染后肺、肝组织激酶与药物整合分析
将DrugBank数据库中的药物与激酶预测结果进行整合分析， 发现11种FDA批准的药物可能对预测的激酶有效，其中福坦替尼（Fostamatinib）、米诺环素（minocycline）和他莫西芬（tamoxifen）在肺和肝脏中可能都起作用（图6）。
图6 药物与恒河猴肺和肝中的激酶桑基图
小结：
与人类的尸检样本相比，恒河猴模型能够提供一个在感染早期研究组织分子变化的机会。研究人员首次对恒河猴SARS-CoV-2感染的肺和肝组织进行了蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析，发现在受感染的肺和肝脏中，蛋白质合成和加工均激活，ECM、细胞间连接和细胞骨架均失调，但肺和肝脏都没有纤维化。并且发现，肺部在感染期间炎症反应增强，而肝脏在感染期间氧化磷酸化和代谢过程增强。该研究为进一步探索SARS-CoV-2的机制和药物发现提供了有效的数据来源。