Result 5: X1.1载体可以将脑内皮细胞转化为一个生物工厂，用于将分泌的蛋白质输送到大脑

血管在脑区各个角落的分布，使脑血管内皮细胞称为“生物工厂”成为可能。

SPARCL1/Hevin基因的下调或错义突变在许多神经系统疾病中都有报道，如自闭症、精神分裂症和抑郁症。在发育中的小鼠视觉皮层中，Hevin对于丘脑皮质连接的形成和可塑性是特别需要的。Hevin基因敲除小鼠(Hevin KO)在出生后的前三周和成年后都表现出明显的谷氨酸偶体转运蛋白2阳性(VGluT2+)丘脑皮质突触的缺失(Figure 4E)。为了确定脑内皮细胞异位表达Hevin是否可以挽救Hevin-KO小鼠的缺陷，作者使用AAV9-X1.1-CAG-Hevin-EGFP的载体，尾静脉注射Hevin-KO小鼠，3周后，结果显示：在脑内皮细胞中，Hevin蛋白稳健而特异性的表达(Figure 4F)。结果表明，由脑内皮细胞产生和分泌的Hevin能够模拟内源性Hevin功能，挽救Hevin-KO小鼠严重缺乏的丘脑皮质突触形成。因此，该系统说明了Hevin相关疾病的潜在治疗策略。

Result 6: X1载体家族在体外有效地转导人脑内皮细胞

AAV9-X1感染内皮细胞(HBMECs)在MOI为3*104时，X1转导了42%的HBMEC，比亲本AAV9高180倍。进一步设计的版本X1.1和X1.2分别转导了44%和53%的HBMEC。

Result 7: X1.1有效地转导体外培养的猕猴和人脑切片

AAV9-X1在HBMECs中的强大表现促使我们研究它们在系统中的功效，该系统可能更好地模拟非人灵长类动物体内条件。因此，作者转向体外脑切片培养系统（Figure 5B）。这些切片是从灵长类动物（长尾猕猴，Macaca Nemestrina）的大脑中新鲜提取的，并在体外培养。

7-10天后，我们从组织中提取DNA和RNA，并使用下一代测序(NGS)计算组织中AAV库中变体的富集程度。与AAV9相比，X1.1的DNA和RNA分别增加了4倍和25倍。值得注意的是，在离体脑切片中，X1.1诱导的蛋白表达主要见于神经元。结果说明：X1.1在猕猴和人类离体切片中的强劲表现(Figure 5F)表明，该衣壳在未来的转化中具有巨大的潜力。

完成了AAV9-X1.1在离体NHP和人脑模型中转导效率的验证后，作者进行了猴的体内实验。作者同时测试了AAV9-CAG-EGFP与AAV9-X1.1-CAG-EGFP，两种载体在新生恒河猴，每只猴5E+13vg/kg，表达4周后，作者观察到与AAV9相比，X1.1在包括皮层、舌回(LG)、海马和小脑在内的大脑区域有较强的表达(Figure 6B)，进一步的免疫组化染色显示，皮层中约98%的X1.1转导细胞是神经元，而一小部分靶向细胞是内皮细胞或胶质细胞(Figure 6D、E)。X1.1的神经元转导比AAV9高约45倍(Figure 6F)。

新生猕猴中X1.1的嗜神经谱与啮齿动物中X1.1的嗜内皮细胞谱之间的差异开辟了潜在的应用，并强调了跨物种分析AAV载体的必要性。这些实验表明，新的衣壳AAV-X1.1可以有效地转导旧大陆猴幼猴的中枢神经系统，使其成为研究神经系统疾病的潜在有用载体。

 小 结

本文讲解了一款新载体AAV-X1.1，尚未搭配内皮细胞的特异性启动子的时候，就已经展现出强劲的血管内皮细胞的精准靶向性。后续的吉凯内部测试中，如果新载体AAV-X1.1，搭配上特异性启动子（TIE或ICAM2），相信会有更好的效果。此外，作者还通过更换血清型，解决了中和抗体，影响AAV二次给药的难题。

目前吉凯基因正在生产AAV-X1.1的试用装，内部测试后，将会推广给老师们使用。

[参考文献]:

1. Chan, K. Y. et al. Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems. Nat. Neu- rosci. 20, 1172–1179 (2017).

2.Ravindra Kumar, S. et al. Multiplexed Cre-dependent selection yields systemic AAVs for targeting distinct brain cell types. Nat. Methods 17, 541–550 (2020).

3.sakova, A., Fehlmann, T., Keller, A. & Quake, S. R. A mouse tissue atlas of small noncoding RNA. Proc. Natl Acad. Sci. USA 117, 25634–25645 (2020).