提前准备好KGM培养基（首次提取为了防止角化细胞分化，建议加2.5%的马血清）
培养基是这样的，套装无血清组分不含动物来源蛋白，500ml一套，使用简单方便。
提前预冷将冲洗组织的缓冲液配制好，我们的建议是50%MEM+50%HBSS+2%PSN配好后放4°冰箱里保存。
眼科剪，眼科镊子， 冰浴提前消毒准备好，0.25%EDTA胰酶准备好
好了，啰嗦了这么多，现在开始了。先来看看我们的提取的细胞图片吧：
使用KGM角化细胞培养基（启达生物，货号：P8001)提取的人皮肤角质细胞7天的细胞生长图
怎么样看完图片心动了吗？
那么我们就开始提取的步骤吧！
表皮角质细胞的分离步骤主要包括以下几步：
1.取厚1.5mm的皮片，（不超过12个小时为佳）用4℃MEM和HBSS混合液冲洗获取的皮肤材料2-3次。冰浴的培养皿里操作，第一次冲去血迹,第二次刮去黏附的其他组织，就留下真皮层和表皮层，在冲洗一次后将组织移入新的培养皿中
2. 将皮肤展平，用手术刀切成2-3mm²的小片，放入中性蛋白酶消化液中，4℃下消化15-20h，或37℃下消化2-4h。
3.用无菌针头和眼科镊子分离真皮与表皮。表皮薄而透明，真皮厚且轻微肿胀并且在胰酶的消化下呈凝胶状。
4.将分离出的表皮块用0.25%胰蛋白酶，在37℃下振荡消化10-30min后，直到表皮组织成絮状后，加入含10%胎牛血清的培养基终止消化。
完成以上步骤后，你已经看到成功分离出表皮角质细胞的曙光了。但是一定要注意，整个过程需要精细的操作和严格的无菌环境，以确保细胞的完整性和活性。
5.用吸管轻轻吹打表皮组织，使细胞从组织块上脱落下来，然后使用100um细胞滤网过滤并将细胞悬液转移到离心管中。
6.在离心管中加入适量KGM角化细胞培养基，然后1000rpm离心5-7分钟，以去除消化液和杂质。
7.弃去上清液，加入新的KGM培养基，轻轻吹打细胞，使其均匀悬浮。48小时后观察细胞贴壁情况(第一次铺板的时候建议加2.5%HS）
8.将细胞悬液接种到适当的培养器皿（如培养皿、培养瓶或培养板）中，加入足量的培养基，并放入细胞培养箱中进行培养。
9.在细胞培养过程中，需要定期更换培养基，以保持细胞的生长环境。同时，也需要观察细胞的生长情况，并根据需要调整细胞密度和传代。
以上步骤完成后，你就可以得到分离纯化的表皮角质细胞，用于后续的实验研究。请注意，实验过程中需要严格遵守无菌操作规范，以避免细胞污染和实验失败。同时，也需要根据实验需要选择合适的培养基和条件，以确保细胞的正常生长和分化,比如角化细胞就使用我们的KGM角化细胞培养基，内皮细胞就使用我们的ECGM内皮细胞培养基.....
在细胞培养过程中，我们需要定期观察细胞的生长状态（一般建议两天观察一次或者一天一次）。健康的角质细胞应该呈现出贴壁生长、形态规则、细胞边界清晰等特征。如果发现细胞出现生长缓慢、形态异常、污染等情况，需要及时采取措施，如更换新的培养基、调整培养条件、传代或重新分离细胞.
怎么样你学会了吗？