肾脏是人体的重要器官之一，负责诸如代谢废物排除和维持电解质平衡等功能，确保体内环境的稳定。肾脏类器官是肾脏功能的三维模型，有助于模拟人类肾脏疾病。它们主要是从体外的人类多能干细胞（PSCs）诱导而来，并且可以表达各种类似于人类肾单位的结构，包括足细胞、近曲小管、远曲小管和集合管。

肾脏类器官培养方法

我们根据发表在Nat Protoc.上的一篇文章[1]，编制了从人类多能干细胞培养人类肾脏类器官的方法。

 Figure 1. Process of hPSC Differentiation into Kidney Organoids (PMID: 28005067)[1]

1、人类多能干细胞（hPSC）

培养 hPSCs被接种到涂有不含LDEV的细胞外基质基质的6孔板中，并在含有10 ng/mL FGF2的ReproFF2培养基中培养。健康的未分化hPSCs表现出明确定义的圆形菌落形态，并且它们每七天使用iPSCs的解离溶液传代一次。

2、人类多能干细胞的分化

当细胞密度达到80%时，使用Accutase解离细胞，重新悬浮在含有10 μM Y27632的ReproFF2培养基中，并接种到涂有不含LDEV的细胞外基质基质的24孔板中。细胞培养3天后，然后更换为Advanced RPMI 1640培养基（含有1× L-GlutaMAX、3~10 μM CHIR99021、5-25 ng/mL Noggin、100-500 nM Dorsomorphin）继续培养，每两天更换一次培养基，直到细胞形成松散的密集细胞团（通常在96小时内）。随后，培养基更换为Advanced RPMI 1640（含有1× L-GlutaMAX、10 ng/mL Activin A）再培养额外的2-3天。

3、诱导hPSC分化为神经前体细胞（NPCs）

培养基更换为Advanced RPMI 1640（含有1× L-GlutaMAX、10 ng/mL FGF9）并培养2天。

Figure 2. Morphological changes during hPSC differentiation.

第0天：开始分化的未分化hPSCs（H9）； 第4天：晚期原条阶段； 第9天：肾小管前体细胞阶段； 第14天：肾囊泡阶段； 第21天：肾单位阶段； 第4天用Activin A处理的细胞最佳形态特征是松散的密集细胞团。

4. 类器官诱导

4.1 神经前体细胞（NPCs）分化为肾脏类器官（2D）

完成步骤3后，更换为Advanced RPMI 1640培养基（含有1× L-GlutaMAX、10 ng/mL FGF9、3 μM CHIR99021），并继续孵化2天。然后更换为Advanced RPMI 1640培养基（含有1× L-GlutaMAX、10 ng/mL FGF9），并培养2-3天。如果观察到类似肾囊泡的极化结构，带有腔室，请进行下一步。如果在3天内未观察到肾囊泡结构，请通过免疫染色确认LHX1的表达。然后更换为Advanced RPMI 1640培养基（含有1× L-GlutaMAX），继续培养，每2-3天更换一次培养基。肾脏类器官在整个分化过程中至少保持3个月的稳定性，并且可以在显微镜下识别肾单位结构。

4.2 人类多能干细胞（hPSCs）分化为肾脏类器官（3D）

完成步骤2后，使用Accutase消化细胞，并在Advanced RPMI 1640培养基（含有1× L-GlutaMAX、10 ng/mL FGF9、3 μM CHIR99021）中重新悬浮。将细胞接种到超低附着圆底96孔板中，并培养2天。然后更换为Advanced RPMI 1640培养基（含有1× L-GlutaMAX、10 ng/mL FGF9），并继续培养2-3天，直到在显微镜下观察到类似肾囊泡的球形结构。

Figure 3. Immunostaining of NPC and renal units (PMID: 28005067)[1]

(a) 在分化的第9天，SIX2的免疫荧光染色显示神经前体细胞（NPC）。比例尺：50 μm； (b) 在2D培养的第21天，通过免疫荧光染色识别分化的肾单位结构。比例尺：50 μm； (c) 在3D培养的第21天，使用冰冻切片识别分化的肾单位结构。比例尺：50 μm； (d) 在3D培养的第28天（左图，比例尺：50 μm）和第21天（右图，比例尺：100 μm）的肾单位的免疫染色。PODXL：足细胞标记物，LTL：近曲小管标记物，CDH1：亨氏环和远曲小管标记物； (e) 3D培养的第21天的类器官的明场图像，箭头指示肾小球结构。

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