细胞转染实验操作注意事项（上）

细胞转染从开始设计到最终的检测，大致可以由6个步骤组成：核酸准备、试剂选择、细胞铺板、转染操作、细胞培养、效果检测。每一步都会影响最终的结果，均存在不同的注意事项。

一、核酸准备

质粒的构建

（1）强度合适的启动子：在构建表达质粒的时候，有一些基因编码出来的蛋白是对细胞有毒性的蛋白，表达会导致细胞死亡。面对这种情况需选择较弱的启动子或者可以诱导的启动子限制毒性基因产物表达对细胞造成的损害。启动子的选择对于转染基因的有效表达是非常重要的，对于转染过程本身虽然无甚影响，但是对转染结果却有着微妙的影响。如果基因产物对细胞有毒性作用，转染也很难进行。
（2）siRNA表达载体的使用：这种方法总体的优点在于不需要直接操作RNA，能达到较长时间的基因沉默效果。大大提高siRNA表达载体对宿主细胞的侵染性,彻底克服某些细胞转染效率低的障碍，是实现哺乳动物细胞siRNAs瞬时表达与稳定表达的理想工具。

质粒的大小和质量

（1）质粒的形态与大小：线性化还是超螺旋会影响转染结果，超螺旋质粒的转染效率比线性DNA高得多，特别是瞬时转染。质粒太大了转染会困难一些。
（2）核酸质量对转染效率影响非常大：一般的转染技术基于电荷吸引原理，如果不纯，如带少量的盐离子，蛋白，代谢物污染都会显著影响转染复合物的有效形成及转染的进行。
用于转染的质粒DNA必须无蛋白质，无RNA和其他化学物质的污染，应确保质粒OD值A260/A280 在1.8~2.0之间。如果DNA不纯，如带少量的盐离子，蛋白、代谢物污染都会显著影响转染复合物的有效形成及转染的进行。
（3）内毒素：内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，目前用的质粒大部分是从大肠杆菌中提取出来的。内毒素通常在质粒制备的裂解中释放出来并与质粒DNA共存，内毒素会导致转染效率显著下降，特别是对内毒素敏感细胞比如原代细胞、悬浮细胞和造血细胞或者想要获得最高的转染效率和最低的细胞毒性。

质粒共转染

合适的比例搭配：对于多个质粒的共转染，每孔DNA的总量不应超过说明书中标明的DNA量。每个质粒的比例根据质粒的大小、结构与预期的各质粒的表达水平而定。在每孔中，每个质粒至少应占总DNA量的10%以上。

二、试剂选择

现在市面上转染试剂种类繁多，质量良莠不齐，如何选择一款合适的转染试剂会显得比较棘手。在考虑合适的转染试剂时，要考虑转染的物质（DNA、RNA、蛋白）以及要转染的细胞特性。
一款好的转染试剂，要具有较高的转染效率，较低的细胞毒性和较合适的价格。
不同细胞系转染效率通常不同，但细胞系的选择通常是根据实验的需要，因此在转染实验前应根据实验要求和细胞特性选择适合的转染试剂。罕见的细胞培养，如神经元和原代细胞等通常难以转染，在转染试剂选择时候更需要慎重与预期的降低。

三、细胞铺板

（1）细胞状态：健康的细胞培养物是成功转染的基础。最适合转染的细胞是经过几次传代后达到指数生长期的细胞，细胞生长旺盛，最容易转染。高的转染效率需要一定的细胞密度，一般的转染试剂都会有专门的说明。如为贴壁生长细胞，一般要求在转染前一日，必须应用胰酶处理成单细胞悬液，重新接种于培养皿或瓶，一般转染时贴壁细胞密度为50%-90%，但这个需要参考所选转染试剂的说明书，尽量在细胞最合适的生理状态下转染，以求最佳的转染效果。
（2）实验目的：不同的实验目的也会影响转染时的铺板密度，比如研究细胞周期相关基因等表达周期长的基因，就需要较低的铺板密度。

限于篇幅，本次就分享到这里，下半部分将会在后续分享。
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