随着越来越多的神经系统疾病尚未被征服，对人类健康构成威胁，理解大脑的全部功能并能够治疗各种神经系统疾病是每位神经科学家致力于的方向。由于实际和伦理的限制，获取实验性脑组织是困难的，传统上，某些啮齿动物经常被用作神经科学研究的模型生物。然而，人类和啮齿动物在脑组织结构和发展上的相似性并不是很高。因此，体外培养脑类器官是一个需要迫切解决的问题。

研究人员可以将人类多能干细胞（hPSCs），包括诱导多能干细胞（iPSCs）和胚胎干细胞（ES），分化为神经细胞，并在体外培养脑类器官以模拟人类环境。这有利于研究人员开发治疗疾病的疗法。

培养步骤

文献1

研究团队开发了一种方法，将人类多能干细胞分化为表达人类中脑特征标记的神经细胞层。他们将患者的皮肤成纤维细胞重新编程为iPSCs，然后将其在含有基础FGF、CHIR-99021和MEK抑制剂（PD0325901）的培养基中培养。

神经诱导培养基（DMEM/F12）：Neurobasal、1:100 N2、1:50不含维生素A的B27、1%谷氨酰胺、10 μM SB-431542、200 ng/mL Noggin、0.8 μM CHIR-99021和10 μM ROCK抑制剂Y-27632、0.1% β-巯基乙醇、1 μg/mL肝素。在前48小时内添加了Y-27632，第二天更换了培养基。

三天后，hMLOs开始挤出神经外胚层芽。此时，完全移除培养基，并立即使用预冷的200 μL移液枪头向每个孔中加入30 μL的低生长因子基质凝胶。嵌入基质中的中脑类器官被放置在37°C培养箱中30分钟以固化基质。

组织生长诱导培养基包含Neurobasal培养基、1:100 N2、1:50不含维生素A的B27、1%谷氨酰胺、0.1% β-巯基乙醇、2.5 μg/mL胰岛素、200 ng/mL层粘连蛋白、100 ng/mL SHH-C25II和100 ng/mL FGF8。

分化培养基由Neurobasal培养基、1:100 N2、1:50不含维生素A的B27、1%谷氨酰胺、100 μM抗坏血酸、125 μM DBcAMP、0.1% β-巯基乙醇、10 ng/mL BDNF和10 ng/mL GDNF组成。为了防止长期培养期间的潜在细菌污染，向培养基中添加了抗生素。每3天更换一次培养基。

Figure 1. Typical Morphology of Cells at Each Stage of Human Midbrain Organoids (SBNC: SB-431542, CHIR-99021, Noggin) [1]

Figure 2. Neuronal Immunostaining [1]

文献2

额颞叶痴呆是一种高度致残的神经系统疾病，以行为、语言和认知障碍为特征。已知tau蛋白的突变与此病密切相关，但具体涉及的机制尚未完全理解。因此，一个研究团队利用人类诱导多能干细胞（iPSCs）构建了表达突变型tau蛋白的额颞叶痴呆的体外脑类器官模型，这些模型表现出大部分损伤。这使得研究者能够阐明神经损伤早期的分子变化，解释病理机制，并发现一种能够抑制神经元死亡的药物，Apilimod。

球状体形成培养基（SFM）：由E8培养基和10 mM ROCK抑制剂Y-27632组成。

分化培养基：E6培养基补充了2.5 mM Dorsomorphin、10 mM SB-431542和2.5 mM XAV-939；每个球状体加入1 mL培养基。轻轻混合球状体并孵化在37°C、5%二氧化碳的环境中48小时。

每天，轻轻吸去培养皿中的培养基，并用分化培养基替换，从第2天到第5天实现65%的培养基交换。第6天，将培养基更换为神经培养基（NM），由神经基础培养基、不含维生素A的B27、谷氨酸和抗A组成，补充了20 ng/mL EGF + 20 ng/mL FGF2。

从第25天开始，用20 ng/mL BDNF和20 ng/mL NT3（培养基C）补充NM，每隔一天补充65%的培养基。从第43天起，每3-4天更换一次培养基，不再添加生长因子，每个培养皿更换15-20 mL培养基，更换75%的培养基。在培养期间，使用一次性手术刀将融合的类器官分开。在下图所示的实验中，诱导多能干细胞被培养和成型。

Figure 3. Longitudinal Axis of Neuronal Survival in Brain Organoids [2]

Figure 4. Images of tau-V337M and wild-type V337V organoids treated with 5 mM glutamate [2]

Figure 5. Images of tau-V337M organoids treated with 5 mM glutamate salt and DMSO [2]

Figure 6. Reversal of Glutamate Excitotoxicity Sensitivity in tau-V337M Organoids by Apilimod [2]

文献3

人类大脑发育表现出几个独特的方面，例如复杂性的增加和神经元输出的扩展，这些已被证明在模型生物中研究是具有挑战性的。因此，模仿人类大脑发育和疾病的体外方法已成为一个热门研究领域。

在这里，一个研究团队建立了一个脑类器官培养模型，该模型模仿内在的发育程序。这个模型可以在标准组织培养箱中培养，并在1-2个月内发育出皮质区域、前脑甚至视网膜组织。这种方法可以应用于发育研究以及各种人类大脑疾病的研究。

此外，由于类器官可以在培养中维持超过一年，它们也有可能模拟神经元成熟和存活等后期事件。

人类多能干细胞生成脑类器官：通过添加L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液、ROCK抑制剂Y-27632、N-2补充剂、不含维生素A的B27、B27+vitA补充剂、青霉素-链霉素、bFGF等。[3]

Figure 7. Progression of Human PSC-Derived Brain Organoid Development [3]

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