书接上回，上周跟大家分享了基于Flex技术的FFPE样本单细胞RNA测序解决方案，其中提到了M20技术也可以对FFPE样本进行单细胞测序。那M20技术有什么特点呢？M20技术和Flex技术比较又各有什么特点呢？下面我们一一道来。首先我们会介绍M20技术原理，技术特点，实测数据质量表现，以及M20文章案例，然后对两种技术进行比较与总结，希望能够帮助大家更好的选择适合自己研究的技术平台。
M20技术原理及工作流程
M20技术基于随机引物扩增原理，可实现全样本类型、全物种、全长RNA的高通量单细胞转录组测序。首先将样本制备成单细胞或单细胞核悬液，对FFPE样本就是分离单细胞核之后进行核膜的透化，使得随机引物以及试剂进入细胞核内，然后随机引物在细胞核内进行原位逆转录以捕获全转录组的全长信息，并在cDNA一链末端加上捕获接头。最后单个细胞核中的cDNA在微液滴平台或者微孔平台上完成细胞标记，随后进行扩增和二代测序。
图 M20 seq技术路线
M20 seq技术优势
▪ 全样本类型：不仅可用于新鲜组织、冻存组织，还可以完美解决FFPE样本难以进行单细胞转录组测序的难题。
▪ 全长序列转录组测序：单细胞全长RNA测序可实现对基因突变、基因融合、拷贝数变异、可变剪接等基因结构的研究。
▪ 全转录组测序：不同于10x的3’RNA捕获和探针捕获原理，基于随机引物的M20技术同时可检测到mRNA和非编码RNA（主要是lncRNA）。实现了单细胞水平对lncRNA进行研究的技术突破。
▪ 跨平台兼容性：在微液滴（如10x）与微孔技术（如BD）平台均能获得优异的检测效果。
▪ 全物种：无论是细菌等原核生物细胞，还是人类、动物、植物等真核生物细胞，都可以通过M20 Seq进行测序。
▪ 超高通量：细胞捕获数大幅提高，最高可达到百万级，是现有单细胞测序技术通量的百倍以上。
图M20 seq技术优势
M20技术对FFPE样本进行实测数据展示
下面为大家展示基于M20技术对FFPE样本单细胞测序的数据质量。首先看一下M20 Genomics官方公布的多种人的FFPE组织样本（如肺癌、肝癌、乳腺癌等）的测试数据，从数据结果来看，测序数据量在100G左右的时候可检测到的细胞数均能达到5000+，单个细胞中位基因数在800-1400之间。看着这样的FFPE样本测序数据结果还是很可喜的！
严谨如我，伯豪同样用FFPE样本对M20技术进行了多次测试评估。这里我们对一例前列腺癌样本同时进行了M20和Flex两种技术检测的数据结果进行展示，在同一样本相同数据量的情况下纵向比较两种技术对FFPE样本进行单细胞测序的数据情况。
（1）FFPE样本单细胞测序基本信息统计
测序基本信息统计中我们重点来看细胞数、中位基因数和检测到的总基因数这三个重要指标。在相同数据量的情况下，实测细胞数是M20 seq检测到的更多（11067>9865），每个细胞的中位基因数检出是10x Flex略显优势（1243>1002），在基因总数检出方面是M20 seq具有独特优势（35757>16427）。
（2）FFPE样本细胞群鉴定结果
在细胞群聚类和注释这一步，通过singleR自动注释，M20的数据仅使用mRNA的高可变基因进行细胞注释的结果与Flex数据结果一致，鉴定出相同的细胞类群。
图 仅用mRNA数据的M20 seq与10x Flex的SingleR注释结果
这里需要强调的是基于随机引物扩增原理的M20 seq不仅能够检测到mRNA，还能检测到非编码RNA（包括lncRNA，miRNA等，主要检测到的是lncRNA）,而基于探针捕获原理的Flex技术目前只能检测mRNA的表达信息。我们进一步利用M20 seq中的mRNA以及lncRNA数据共同进行降维聚类，SingleR注释结果发现比10x Flex增加了中性粒细胞、平滑肌细胞群。
看到这个结果不知大家是否有疑问：同一样本，为什么增加了lncRNA信息之后细胞群注释“凭空”多出了两种细胞类群呢？严谨如我，小编用经典marker基因进行人工注释确实验证了这个样本是有中性粒细胞和平滑肌细胞存在的。这证明了增加lncRNA可提升细胞聚类注释效果，提高单细胞数据的细胞群鉴定分辨率，有可能发现新的细胞亚群。
图 M20 Seq基于mRNA以及非编码RNA进行降维聚类、SingleR注释
（3）lncRNA占比分析结果统计
以往的单细胞转录组能够检测到的lncRNA很少，因此目前单细胞水平的lncRNA研究有较大空白。从上述的细胞注释结果能够看出增加lncRNA的单细胞数据可能提供更多的生物学信息。那M20 技术能够检测到多少lncRNA呢？从M20 Seq检测数据统计结果可以看到，每个细胞检测到的lncRNA占比在6%-30%。从这个结果小编看到了单细胞中具有重要生物学意义的lncRNA在向我们招手！
M20技术对FFPE样本进行单细胞核测序的文章案例
下面跟大家分享一篇M20 Genomics团队近期在NC期刊发表的M20 Seq技术对FFPE样本进行单细胞核测序的文章。
文章标题：High-throughput single nucleus total RNA sequencing of formalin-fixed paraffin-embedded tissues by snRandom-seq
发表期刊：Nature Communications
发表时间：2023年5月
文章摘要：该研究介绍了通过随机引物捕获全长总RNA，用于FFPE组织的单细胞核测序新技术——SnRandom-seq（也就是M20 seq）。文章首先展示了SnRandom-seq对FFPE小鼠组织和FFPE人肝癌样本进行单细胞核测序（SnRNA-seq）的结果，说明SnRandom-seq技术可为临床FFPE样本提供一个强大的SnRNA-seq平台。然后从相同的小鼠组织中收集FFPE和新鲜样本，通过SnRandom-seq发现它们的RNA表达具有很高的相关性。最后文章还对SnRandom-seq与其他两种FFPE snRNA-seq方法进行了比较，重点强调了SnRandom-seq对lncRNA的检出优势，以及snRandom-seq可以捕获FFPE组织中更多的RNA，且基因覆盖度更高。
图 snRandon-seq与其他两种FFPE snRNA-seq方法的比较
小编以为，文章中还有一个亮点值得拎取出来展示。那就是snRandom-seq在FFPE样本中可以同时检测到外显子和内含子序列，可以用于区分新转录的RNA（未剪接）和成熟的RNA（未剪接），因此更适合于RNA速率分析。再结合细胞周期分析，就能更好地探究细胞分化轨迹。
图 基于snRandom-seq数据分析FFPE小鼠睾丸组织的细胞分化轨迹及细胞周期状态
首先，FFPE样本的实测数据和两种技术的案例文章足以证明M20技术和Flex技术都实现了对FFPE样本进行单细胞测序的技术突破。那问题就来了：哪种技术更好？应该怎么选呢？下面小编就来进行两种技术特点的总结与比较，希望能够解决大家的困扰。
基于技术原理的不同，M20技术（随机引物进行原理逆转录原理）和Flex技术（探针杂交捕获原理）进行FFPE样本单细胞测序各有特色：
（1）在样本类型方面：两种技术都能够对FFPE样本，冻存样本，新鲜组织样本等多种类型的样本进行检测。这里再次强调对FFPE样本单细胞测序技能的解锁，简直就是打开了临床病理样本资源库，应用前景不可限量。
（2）在物种适用方面：Flex技术目前仅适用于人和小鼠，M20技术没有物种限制，人、动植物及微生物均适用。就FFPE样本而言，适用于人和小鼠两个物种其实基本已经满足大家研究需要了。
（3）在测序数据方面：就目前我们实测的FFPE样本数据来看，Flex技术检测到的中位基因数略占优势，而在检测到的基因总数上M20技术是占绝对优势的（Flex检测基因总数最高18000，M20 检出的基因总数可达30000-40000）。
（4）在数据挖掘方面：Flex技术只能检测到FFPE样本中的mRNA表达信息，而M20技术能够同时检测到mRNA和非编码RNA表达特征。所以M20技术在单细胞水平挖掘有重要生物学含义的非编码RNA这一研究方向具有独特优势。
相较于一决高下，我们更期待看到的是百花齐放，百家争鸣的局面。所幸事实如此，M20和Flex技术总结比较下来，确实很难评出优劣。据此，伯豪生物同时引进M20和Flex两种技术，希望能够为大家提供更广泛的科研服务。那想要对FFPE样本进行单细胞测序，这两种技术该如何选择呢？在此给出一些具体建议供大家参考：
（1）看重测序数据中的中位基因数这一指标，从当前样本来看，10x Flex检测出的中位基因数更具优势。一方面在原理上是因为基因特异性探针的灵敏度和特异性更高，更加容易覆盖中低丰度基因；另一方面M20在当前数据量下的细胞数略多，加大测序深度可能会增加中位基因数。我们可以期待后面更多的实测数据对比；
（2）看重测序数据中检测到的基因总数，或者想挖掘新基因，建议选择M20 seq；
（3）想要同时对FFPE样本进行单细胞RNA测序和空间转录组测序，建议选择10x Flex单细胞RNA测序和Visium FFPE空间转录组测序。两种技术用到是同一套探针，所以两种数据的联合分析相关性会更高；
（4）想要在单细胞水平关注非编码RNA，特别是lncRNA的表达信息，挖掘FFPE样本中重要的lncRNA生物标志物，建议选择M20 seq；
（5）更个性化的想法与需求就需要我们共同沟通探讨选择更优方案。