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百萤生物带你了解凝胶迁移实验（EMSA）

作者：西安百萤生物科技有限公司 2019-01-25T14:01 (访问量:5669)

凝胶迁移实验（EMSA）
凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA）可以：（1）研究 DNA 结合蛋白和其相关的 DNA
结合序列相互作用；（2）可用于 DNA 定性和定量分析；（3）用于研究 RNA 结合蛋白和特
定的 RNA 序列的相互作用。
凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一种研究
DNA 结合蛋白和其相关的 DNA 结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技
术最初用于研究 DNA 结合蛋白，目前已用于研究 RNA 结合蛋白和特定的 RNA 序列的相互作
用。通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和 32P 同位素标记的 DNA 或 RNA 探针一同保温，在非
变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或 RNA-复合物比非结
合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。当检
测如转录调控因子一类的 DNA 结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。
在检测 RNA 结合蛋白时，依据目的 RNA 结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也
可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的 DNA 或 RNA 片段和寡核苷酸
片段（特异），和其它非相关的片段（非特异），来确定 DNA 或 RNA 结合蛋白的特异性。
在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。
DNA 样品
[γ-32P]ATP、T4 多聚核.苷.酸激酶、Nuclease-Free Water、T4 多聚核.苷.酸激酶缓冲液、醋
酸.铵、TE、无水乙醇、TBE buffer、重蒸水、甲叉双.丙.烯.酰.胺、丙.烯.酰.胺、甘油、过硫.酸.铵、
TEMED（四甲基乙.二.胺）、EMSA Gel-Shift 结合缓冲液、溴酚蓝等
水浴锅、PCR 仪、离心机、电泳仪、电泳槽等
一、探针的标记
1. 如下设置探针标记的反应体系：
（1）待标记探针 (1.75 pmol/微升) ：2 微升。
（2）T4 Polynucleotide Kinase Buffer (10X) ：1 微升。
（3）Nuclease-Free Water ：5 微升。
（4）[γ-32P]ATP(3 000 Ci/mmol at 10 mCi/ml) ：1 微升。
（5）T4 Polynucleotide Kinase (5-10 u/微升) ：1 微升。
（6）总体积：10 微升
（7）按照上述反应体系依次加入各种试剂，加入同位素后，Vortex 混匀，再加入 T4
Polynucleotide Kinase，混匀。
2. 使用水浴或 PCR 仪，37℃反应 10 分钟。
3. 加入 1 微升探针标记终止液，混匀，终止探针标记反应。
4. 再加入 89 微升 TE，混匀。此时可以取少量探针用于检测标记的效率。通常标记的效率在
30%以上，即总放射性的 30%以上标记到了探针上。为实验简便起见，通常不必测定探针的
标记效率。
5. 标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过 3 天。标记好的探针可以保存在- 20℃。
二、探针的纯化
通常为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针。在有些时候，纯化后的探针会改善 EMSA
的电泳结果。如需纯化，可以按照如下步骤操作
1. 对于 100 微升标记好的探针，加入 1/4 体积即 25 微升的 5 M 醋酸铵，再加入 2 体积即
200 微升的无水乙醇，混匀。
2. 在-70℃至-80℃沉淀 1 小时，或在-20℃沉淀过夜。
3. 在 4℃，12 000 g-16 000 g 离心 30 分钟。小心去除上清，切不可触及沉。
4. 在 4℃，12 000 g-16 000 g 离心 1 分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀，但不宜过分干
燥。
5. 加入 100 微升 TE，完全溶解沉淀。标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超
过 3 天。标记好的探针可以保存在 -20℃。
三、EMSA 胶的配制
1. 准备好倒胶的模具。可以使用常规的灌制蛋白电泳胶的模具，或其它适当的模具。最好选择
可以灌制较薄胶的模具，以便于干胶等后续操作。为得到更好的结果，可以选择可灌制较大
EMSA 胶的模具。
2. 按照如下配方配制 20 毫升 4％的聚.丙.烯.酰.胺凝胶(注意：使用 29:1 等不同比例的 Acr/Bis
对结果影响不大)。
（1）TBE buffer (10X)： 1 毫升。
重蒸水：16.2 毫升。
（2）39:1 acrylamide/bisacrylamide (40%,w/v)： 2 毫升。
（3）80% 甘油： 625 微升。
（4）10% 过.硫.酸.铵 (ammonium persulfate) ：150 微升。
（5）TEMED ：10 微升
3. 按照上述次序加入各个溶液，加入 TEMED 前先混匀，加入 TEMED 后立即混匀，并马上加
入到制胶的模具中。避免产生气泡，并加上梳齿。如果发现非常容易形成气泡，可以把一块
制胶的玻璃板进行硅.烷化处理。
四、EMSA 结合反应
1. 如下设置 EMSA 结合反应
阴性对照反应：
（1）Nuclease-Free Water ：7 微升。
（2）EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) ：2 微升。
（3）细胞核蛋白或纯化的转录因子： 0 微升。
（4）标记好的探针：1 微升。
（5）总体积：10 微升。
样品反应：
（1）Nuclease-Free Water ：5 微升。
（2）EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) ：2 微升。
（3）细胞核蛋白或纯化的转录因子：2 微升。
（4）标记好的探针： 1 微升。
（5）总体积： 10 微升。
探针冷竞争反应：
（1）Nuclease-Free Water ：4 微升。
（2）EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) ：2 微升。
（3）细胞核蛋白或纯化的转录因子： 2 微升。
（4）未标记的探针： 1 微升。
（5）标记好的探针： 1 微升。
（6）总体积：10 微升。
突变探针的冷竞争反应：
（1）Nuclease-Free Water ：4 微升。
（2）EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) ：2 微升。
（3）细胞核蛋白或纯化的转录因子：2 微升。
（4）未标记的突变探针： 1 微升。
（5）标记好的探针： 1 微升。
（6）体积：10 微升
Super-shift 反应：
（1）Nuclease-Free Water：4 微升。
（2）EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) ：2 微升。
（3）细胞核蛋白或纯化的转录因子：2 微升。
（4）目的蛋白特异抗体：1 微升。
（5）标记好的探针：1 微升。
（6）总体积：10 微升。
2. 按照上述顺序依次加入各种试剂，在加入标记好的探针前先混匀，并且室温(20-25℃)放置
10 分钟，从而消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合，或者让冷探针优先反应。然后加
入标记好的探针，混匀，室温(20-25℃)放置 20 分钟。
3. 加入 1 微升 EMSA/Gel-Shift 上样缓冲液(无色，10X)，混匀后立即上样。注意：有些时候
溴酚蓝会影响蛋白和 DNA 的结合，建议尽量使用无色的 EMSA/Gel-Shift 上样缓冲液。如果
对于使用无色上样缓冲液在上样时感觉到无法上样，可以在无色上样缓冲液里面添加极少量的
蓝色的上样缓冲液，至能观察到蓝颜色即可。
五、电泳分析
1. 用 0.5XTBE 作为电泳液。按照 10V/厘米的电压预电泳 10 分钟。预电泳的时候如果有空余
的上样孔，可以加入少量稀释好的 1X 的 EMSA 上样缓冲液(蓝色)，以观察电压是否正常进
行。
2. 把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内。在多余的某个上样孔内加入 10 微升稀释好的
1X 的 EMSA/Gel-Shift 上样缓冲液 (蓝色)，用于观察电泳进行的情况。
3. 按照 10 V/厘米的电压电泳。确保胶的温度不超过 30℃，如果温度升高，需要适当降低电
压。电泳至 EMSA/Gel-Shift 上样缓冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘 1/4 处，停止电
泳。
4. 剪一片大小和 EMSA 胶大小相近或略大的比较厚实的滤纸。小心取下夹有 EMSA 胶的胶
板，用吸水纸或普通草纸大致擦干胶板边缘的电压液。小心打开两块胶板中的上面一块(注：
通常选择先移走硅.烷化的那块玻璃板)，把滤纸从 EMSA 胶的一侧逐渐覆盖住整个 EMSA 胶，
轻轻把滤纸和胶压紧。滤纸被胶微微浸湿后(大约不足 1 分钟)，轻轻揭起滤纸，这时 EMSA 胶
会被滤纸一起揭起来。把滤纸侧向下，放平，在 EMSA 胶的上面覆盖一层保鲜膜，确保保鲜
膜和胶之间没有气泡。
5. 干胶仪器上干燥 EMSA 胶。然后用 X 光片压片检测，或用其它适当仪器设备检测。

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