翌圣UDG酶：PCR反应中的“防污专家”

操作环境中的气溶胶污染是造成PCR结果假阳性最常见的因素。美国科学家Lindahl最早在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中发现了UDG酶（Uracil DNA Glycosylase，尿嘧啶DNA糖基化酶），UDG酶与dUTP搭配使用，可建立PCR防污染体系，保证PCR扩增结果的准确性。

UDG酶可有效催化水解单链或双链DNA中的尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架的N-糖苷键，但对RNA无活性。使用UDG酶时，以dUTP取代dTTP进行PCR扩增，在PCR反应开始前，UDG酶能降解含尿嘧啶的PCR产物，消除PCR残余污染。

UDG酶作用原理

dUTP/UDG酶是作为PCR反应体系的配制成分发挥防污染作用的。PCR反应前，在25℃、10 min的条件下，UDG酶催化水解含有dU-DNA链中的尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架的N-糖苷键，产生缺嘧啶位点，释放游离尿嘧啶。然后进行95℃、10 min热处理，使UDG酶失活。同时，高温使得缺嘧啶位点的磷酸骨架极易水解断裂，从而消除含有尿嘧啶的PCR产物的污染。天然的、未经修饰的DNA不含dU，不受UDG酶影响，可继续作为PCR/qPCR扩增的模板进行扩增。

图1. dUTP/UDG酶防污染系统去除残留扩增污染物示意图

翌圣生物-Uracil DNA Glycosylase (UDG/UNG)

Uracil DNA Glycosylase (UDG/UNG) , 1 U/μL（Cat#10303ES）来源于嗜冷海洋细菌，是经大肠杆菌表达纯化的重组蛋白，在25-37℃发挥活性， 可轻松控制气溶胶污染，适用于PCR、qPCR、RT-qPCR及RT-LAMP等常见分子生物学体系。

1）10 U本品经E.coli 16S rDNA特异性的TaqMan qPCR检测，E.coli基因组残留低于10拷贝。

2）无核酸内外切酶和RNase残留。

3）尿嘧啶是此酶识别的唯一碱基。

1）根据实验需要，dUTP终浓度可在0.2~0.6 mM之间调整，并选择性掺入0.2 mM dTTP。

2）反应体系中UDG酶的添加量为1个单位，30 min内可消化1 μg dU-DNA。

3）PCR反应程序前加上25℃~37℃，2~10 min的保温步骤活化UDG酶活性。

4）根据实验需求，正常进行后续PCR程序。

图2. 0.05 U、0.025 U、0.0125 U、0.00625 U、0.003125 U防污染 UDG酶与360 ng 200 bp dU-DNA在25℃孵育30 min电泳结果图。

图3. 不同浓度防污染UDG酶可兼容qPCR以及RT-qPCR反应体系，对DNA及RNA模板扩增无抑制。

1）去除单链或双链DNA中的尿嘧啶碱基，对RNA无活性。

2）去除PCR残留污染，消除由于PCR扩增产物的污染导致的假阳性结果。

3）适用于PCR、qPCR、RT-qPCR等反应。

FAQ

Q1: UDG酶可以用于已存在的扩增产物气溶胶污染吗？
A: 已存在的扩增产物气溶胶污染不含dU，此时UDG酶不能发挥作用。建议选取其他扩增区域，重新设计引物，并建立dUTP/UDG酶防污染系统，即可避免“未来”的气溶胶污染。

Q2: dUTP会影响扩增产物的dU-DNA在杂交、测序、克隆和酶切等方面的下游应用吗？

A：含dU的PCR产物可正常进行核酸杂交和测序，效果与常规PCR产物无差别。在分子克隆实验中，连接产物需使用UDG酶缺失的感受态细胞进行转化和质粒扩增。酶切实验中，已证实EcoRI和BamHI不受dU影响，但HindIII酶切效率有所降低，更多内切酶效果还需自行尝试。

Q3: 含dU的PCR产物后续做了连接和转化，无克隆，这是什么原因？

A: 需要特别注意在分子克隆实验中，连接产物需使用UDG酶缺失的感受态细胞进行转化和后续的质粒扩增。

Q4: UDG酶会切割RNA吗？

A: 不会。在生物体内，UDG酶在DNA修复过程中发挥重要作用。它可以修复dC脱氨基形成dU的突变，进而避免GC碱基对突变为AT碱基对的可能。

Q5: UDG酶反应Buffer是什么？

A: UDG酶可以在各类缓冲液中发挥作用，如常规的Taq酶Buffer、连接酶Buffer、酶切Buffer等。

Q6: UDG酶对DNA链的碱基个数有要求吗？

A: 不能从6碱基或更少的寡核苷酸上水解尿嘧啶。