肥胖作为一个世界性的健康问题，越来越受到人们的关注。本研究鉴定了一种在包括小鼠和人类间高度保守的长非编码RNA NRON，是葡萄糖/脂质代谢和全身能量消耗的重要调节因子。Nron的缺失会给DIO（饮食诱导肥胖）小鼠带来代谢益处，包括减轻体重和脂肪量、改善胰岛素敏感性和血脂参数、减轻肝脂肪变性和增强脂肪功能。研究发现，NKO（Nron 敲除）小鼠对由高脂肪饮食（HFD）引起的肥胖导致的代谢异常具有高度抵抗力。从机制上讲，Nron的缺失会诱导肝脏中FGF21的表达，并缓解FGF21的抵抗状态，从而通过AMPK依赖性方式减轻肝脏脂肪变性。此外，研究还发现Nron缺失增强了脂肪组织中的儿茶酚胺敏感性和脂质循环活性，对增加HFD喂养期间的能量消耗有很大贡献。这些效应共同维持NKO小鼠更健康的代谢表型。

RNA-seq、代谢组、脂质组

1. NKO 小鼠免受饮食引起的肥胖

NKO小鼠和WT野生型小鼠都接受HFD和SCD（标准对照饮食）喂养，SCD喂养组中没有体重差异，而与WT小鼠相比，HFD喂养的NKO小鼠体重明显减少（图1A、1B）。CT扫描进行的身体成分分析也表明，NKO小鼠的脂肪量较少，SCD喂养的内脏脂肪和和HFD喂养的内脏脂肪、皮下脂肪均减少（图1C、1D）。为了更好地了解肥胖减少的原因，研究人员对仅接触HFD 6 周（体重出现差异之前）的小鼠进行了全身能量代谢研究。不同基因型之间的食物摄入量和运动活动没有差异（图 1E、1F）。在HFD喂养条件下，NKO小鼠的总耗氧量明显高于WT幼崽(图1G、1H)，呼吸交换比(RER)降低(图1I、1J)，表明脂肪酸被用作优先的能量底物。此外，NKO小鼠在HFD喂养期间计算的每日能量消耗也增加(图1K和1L)。

2. NKO小鼠具有更高的葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性

对葡萄糖的稳态测定发现，在HFD喂养6周后，在两组之间的体重没有差异的情况下，NKO小鼠表现出更好的葡萄糖和胰岛素耐受能力（图2A- 2D）。NKO小鼠的 HOMA-IR 值（胰岛素抵抗指标）也较低（图2E）。此外，还评估了肝脏中的胰岛素信号传导，发现NKO小鼠中胰岛素诱导的AKT磷酸化比WT小鼠更明显增加，但mTOR/S6K磷酸化没有相应增加（图2F、2G） 。

3. NKO小鼠不受HFD诱导的肝脂肪变性

对小鼠的血清和肝脏脂质代谢测定结果发现，HFD喂养条件下NKO小鼠血清游离脂肪酸 (FFA)水平显著低于WT小鼠。但是，血清甘油三酯（TG）和胆固醇水平没有显着差异（图3A-3C）。值得注意的是，肉眼观察、油红O染色和肝脂质定量显示，HFD条件下，NKO小鼠的肝脏脂肪变性较少，肝脏中TG的积累减少（图3D-3E、3H）。肝脏游离脂肪酸和胆固醇含量无明显变化（图3F、3G）。此外，NKO小鼠的ALT水平显着降低（图3I）。但是，通过 F4/80 或 c-caspase3 染色的组织学分析，没有观察到肝脏炎症和细胞凋亡的差异（图3J 、3K）。

4. 小鼠肝脏RNA-Seq和代谢组学

为了深入了解 NKO对肝脂肪变性保护作用的分子过程，对HFD喂养的WT和NKO小鼠进行mRNA-seq测序，分析得到403个下调基因，304个上调基因。脂质代谢通路在NKO肝脏中显富集（图 4A 和 4B）。由于NKO肝脏中TG和FFA沉积减少，重点研究了与脂肪酸和甘油脂代谢相关的基因表达的变化，发现参与脂肪形成的基因（AcacB、FASN、SCD1、Elovl6）在NKO肝脏中都比WT组下调(图4C)。QPCR证实了这一结果（图 4D）。然而，与FA摄取（CD36、Fabp1、Fatp2）、FA氧化(CPT1a、Acox1、Cyp4a10)以及炎症(Tnf-α, Il1-β, and Il-6)相关的基因在两组中的表达没有差异（图4E）。但Nron缺失既不影响p65的磷酸化，也不影响炎症基因的表达（图4D）。相比之下，观察到NKO肝脏中 AMPK的激活增加，SREBP-1靶基因FASN 和SCD1 的蛋白质水平持续下降（图 4F）。另外，观察到HFD喂养的NKO小鼠肝脏中的中链和长链酰基肉碱显著减少（图 4G)，血清β-羟基丁酸的增加也明显改善了FAO（图4H）。QPCR结果显示，与 WT 小鼠相比，NKO 小鼠肝脏中的Fgf21有所增加（图 4I）。HFD 喂养期间，两组的血清中FGF21表达逐渐增加，但在NKO小鼠中FGF21水平在在整个16 周HFD喂养期间维持在较高水平（图 4J），相反，在基础条件下，WT 和 NKO 小鼠的脂联素和瘦素血清水平没有差异。本研究中，证明 NKO 小鼠肝脏中的 FGF21 蛋白水平肯定升高，而脂肪组织中的FGF21蛋白水平没有变化（图 4K）。为了测试这些效应是否是细胞自主的，从 WT 和 NKO 肝脏中分离出原代肝细胞，NKO 肝细胞中FGF21 的蛋白水平随着 AMPK 激活和 SREBP-1/FASN抑制而升高，但当FGF21 被敲低时，这种影响被消除（图4L）。同样，油红O染色和TG定量显示，FGF21敲低完全消除了Nron缺失对培养肝细胞脂质沉积的保护作用(图4M和N)。

5. Nron与KPNB1相互作用调节PER2/Rev-Erbα/FGF21

据报道，Nron 与几种不同的蛋白质成分相互作用，这些蛋白质成分参与翻译后修饰和信号转导，或参与蛋白质周转和核质运输，或充当支架蛋白（图 5A）。作者首先通过功能缺失实验研究了这些蛋白在FGF21表达中的作用，发现NKO细胞中FGF21的诱导被KPNB1敲低所抵消(图5B)。此外，Nron与KPNB1的相互作用通过RNA Pull-down（图5C）和RNA免疫沉淀测定（图5D）进行了验证。几个核心生物钟基因（Per1、Per2、Rev-Erbα）在NKO小鼠的肝脏中下调，QPCR验证结果一致（图5E）。接下来用肝脏原代细胞确定了昼夜节律成分的蛋白质水平（图5G）。用免疫荧光测定证实了NKO 肝细胞中PER2的显着核定位（图5H）。此外，研究还发现在免疫共沉淀分析中PER2与KPNB1相互作用，并且这种相互作用在NKO肝细胞中显着增加（图5I）。相反，Period家族的另一个成员PER1不与KPNB1 结合（图5J）。相应地，KPNB1的敲低完全逆转NKO肝细胞中PER2增加的核积累（图5K）。PER2的敲低消除了NKO肝细胞中FGF21的诱导，并且Rev-Erbα的联合敲低恢复了FGF21水平，而Nron OE减少了FGF21的表达，并且Rev-Erbα敲低完全逆转了抑制（图5L、5M）。Fgf21荧光素酶报告结果显示，与WT组相比，NKO细胞的荧光素酶活性显著增加(图5N)。根据研究结果，作者认为Nron通过KPNB1/PER2/REV-Erbα轴调节FGF21的表达。接着，还检测了Nron对核心clock基因表达的影响，发现Nron缺乏并不影响clock和Bmal的节律性(图50)，这与的RNAseq结果一致。

6. Nron缺失可通过FGF21减轻肝脏脂肪变性

为了确定NKO小鼠的表型可能是FGF21诱导肝脏的结果，制备了携带FGF21 shRNA的AAV8(AAV8-shFGF21)，然后将其静脉注射到WT和NKO小鼠体内，以诱导肝脏中FGF21的敲除（KD）。KD肝脏中FGF21的含量降低了70%以上(图6A)。值得注意的是，即使在FGF21被敲除的情况下，接受HFD喂养的NKO小鼠的体重和脂肪质量也低于WT小鼠(图6B、6C)。然而，NAFLD的改善完全减弱(图6D-6I)，表明FGF21依赖对肝脏脂肪变性的保护作用。同样的，当FGF21被击倒时，NKO小鼠AMPK的激活和对脂肪生成的抑制完全被取消(图6J和L)。

7. Nron缺失促进脂肪细胞脂解

为了更清楚地阐明Nron对能量代谢的作用机制，对脂肪组织进行研究，组织学分析和细胞大小定量显示，HFD喂养的NKO小鼠的表皮脂肪细胞比对照组小(图7A-7C)，NKO小鼠的脂肪组织巨噬细胞和冠状结构的数量少于WT小鼠(图7A、7D)。此外，对EPWAT中代谢中间产物的分析显示，NKO小鼠中与三羧酸(TCA)循环相关的代谢物急剧增加，包括终末代谢物琥珀酸和富马酸，此外，还观察到环腺苷一磷酸(cAMP)水平升高(图7E和7F)。接着使用p-(Ser/Thr) PKA底物抗体来检测脂肪PKA底物，并证明在NKO小鼠的epiWAT中PKA活性确实增强（图7G）。NKO 和 WT 外植体之间的基础甘油和FFA释放没有差异，但NKO小鼠的epiWAT中ISO刺激的甘油和 FFA 释放显着增加。相反，胰岛素对脂肪分解的抑制作用不受影响（图7I、7J）。从NKO和 WT小鼠中分离出附睾SVF，并刺激其分化为脂肪细胞，然后进行脂肪分解测定。Nron 敲除不影响脂肪分化（图7K 和L）。在分化的NKO脂肪细胞中，ISO刺激的甘油和FFA释放仍然增加（图7M和N），同时伴随着PKA活性和HSL磷酸化的增强（图7O），表明 Nron 具有脂肪分解的细胞自主功能。当 FGF21 被敲低时，在NKO小鼠中观察到的脂肪分解增加被保留（图7P）。相比之下，尽管血清FGF21水平与对照组相比显着增加，LiNKO小鼠没有表现出脂肪分解改变（图7Q）。

参考文献：

Please cite this article as: B. Liu, Y. Zhong, D. Huang, et al., LncRNA Nron deficiency protects mice from diet-induced adiposity and hepatic steatosis, Metabolism (2023), https://doi.org/10.1016/j.metabol.2023.155609