目前，确定慢性HBV（乙型肝炎病毒）感染的患者何时开始抗病毒治疗是一个有争议的问题。其中一个关键原因是区分慢性HBV感染自然进程的生物标志物开发不充分，不能满足临床实践需要。
福建医科大学附属第一医院研究团队在Materials Today Bio（IF:10.761）上发表了题为“Proteomic characterization of the natural history of chronic HBV infection revealed by tandem mass tag-based quantitative proteomics approach”的文章，揭示了慢性HBV感染自然进展过程中患者血清中的蛋白质变化，以期找到相关的生物标志物。吉凯基因提供了TMT蛋白质组学服务。
考虑到丙氨酸氨基转移酶（ALT）、乙型肝炎E抗原（HBeAg）、HBV DNA水平和肝脏炎症出现的情况，慢性HBV感染的自然史（自然进程）可大致分为四个阶段：
1. 免疫耐受（IT）或HBeAg阳性慢性感染；
2. 免疫反应性HBeAg阳性（IA）或HBeAg阳性慢性肝炎；
3. 非活跃HBV携带状态（IC）或HBeAg阴性慢性感染；
4. HBeAg阴性慢性肝炎（ENH）。
其中，IA和ENH患者应该进行抗病毒治疗，而IT患者则不宜进行抗病毒治疗。但部分IT患者表现出和IA类似的特征，这一部分也应进行相应的治疗干预，以防止更严重的疾病进展。但在当前的临床实际中，有一些不确定的情况，使得医生很难判定是否进行相关干预治疗。本研究旨在寻找慢性HBV感染不同阶段的血液蛋白标志物，为临床干预治疗提供科学依据。
血清蛋白质组学分组策略
收集以上四类疾病阶段的病人血清样本，每10人的样本混合为1个样本。收集齐样本后（IT：2；IA：4；IC：2；ENH：2）先进行去高丰度蛋白，随后进行TMT蛋白质组学检测。
研究结果
1. 慢性HBV感染自然进程中的差异蛋白
血清TMT蛋白质组学（去除高丰度蛋白）共检测到了1162个蛋白。沿着慢性HBV感染进程，共筛选得到116个差异蛋白（DEP）。GO富集分析显示，这些DEP富集在免疫学过程包括白细胞介导的免疫、免疫响应和免疫效应过程。Reactome pathway分析显示，DEP主要映射到固有免疫系统和免疫系统。这些结果表明，慢性HBV感染不同阶段的蛋白表达变化主要聚焦在免疫病理过程。对226个DEP进行STEM趋势分析，共显示有20个表达趋势簇。其中，只有3个趋势簇具有统计学显著性，包括簇15：反映ALT（丙氨酸氨基转移酶）的表达；簇17：IT阶段最低表达以及簇18：ENH阶段最高表达。
2. 慢性肝炎和慢性HBV感染间的差异蛋白分析
研究者分析了慢性肝炎（IA+ENH）与慢性感染（IT+IC）之间的差异蛋白。热图显示了这两种状态下血清蛋白质特征的特异性。火山图展示了两组间的136个差异蛋白，包括130个上调蛋白和6个下调蛋白。和预期一致，很多酶在慢性肝炎组中高表达，包括ALT（丙氨酸氨基转移酶）和AST（天冬氨酸氨基转移酶）。Wiki Pathway分析显示，136个蛋白主要聚集在蛋白酶体降解、糖酵解/糖异生和氨基酸代谢途径。GSEA分析的结果和上述结果高度一致。尤其是，聚类分析显示属于蛋白酶体途径的两个蛋白酶体激活亚基1（PSME1）和蛋白酶体亚基α7（PSMA7）显示了最高表达。因此，研究者用ELISA检测了血清中的PSME1和PSMA7，结果和蛋白组学的结果一致，相比于慢性感染组，PSME1和PSMA7在慢性肝炎中高表达。总体，这些结果表明蛋白酶体通路是最显著上调的通路，而PSME1和PSMA7在慢性肝炎中高表达。
3.IA（免疫反应性HBeAg阳性）和IT（免疫耐受）之间的差异蛋白分析
IA（免疫反应性HBeAg阳性）和IT（免疫耐受）的患者有高水平的HBV DNA，但是ALT水平则波动较大。为了进一步研究蛋白变化，研究者比较了IA组和IT组的蛋白表达法。火山图展示了两组间的119个差异蛋白，包括105个上调蛋白和14个下调蛋白。特别地，CD163是上调最显著的蛋白。CD163在IA组中的高表达也得到了ELISA实验的验证。总体上，慢性HBV感染的患者血清与健康人相比有更高的CD163水平。KEGG和GSEA分析表明，蛋白酶体途径是最显著上调的通路。研究者用ELISA检测了血清中蛋白酶体途径相关蛋白，与蛋白质组学结果一致，与IT患者相比，IA患者表达高水平的PSME1、PSMA7、PSMA6和PSMB10。慢性HBV感染的不同阶段比健康人高表达PSMA6。总体，这些结果表明，相比于IT阶段的患者，IA阶段的患者高表达CD163和多种蛋白酶体相关蛋白。
4. IT（免疫耐受）和非活跃HBV携带状态（IC）之间的差异蛋白分析
IT和IC阶段没有或只有很小程度的炎症坏死或纤维化，但它们具有不同的病毒载量。火山图展示了IT组和IC之间的50个差异蛋白。这50个差异蛋白的KEGG分析显示主要富集在糖酵解/糖异生途径。特别地，聚类图显示EEF2（elongation factor 2）是最显著上调的蛋白，而MOYC和EFNB2是最显著下调的蛋白。由于缺少EEF2的ELISA试剂盒，作者检测了热反应蛋白12（HRSP12）的水平，该蛋白在IT阶段也显著增加。在慢性HBV感染的不同阶段，皮尔森相关性分析显示EFNB2水平与HBeAg、HBV DNA和HBsAg水平呈负相关。HRSP12与HBeAg、HBV DNA和HBsAg呈正相关。
5. ENH（HBeAg阴性，慢性感染）和IC（非活跃HBV携带状态）之间的差异蛋白分析
ENH和IC阶段的特征是HBeAg阴性。研究者进一步比较了ENH和IC之间的蛋白质差异。火山图展示了两组间的55个差异蛋白，包括43个上调蛋白和12个下调蛋白。特别地，聚类图显示SOD2是最显著上调的蛋白。GSEA分析显示，ENH组只有糖酵解/糖异生途径是上调的。Wiki Pathway和KEGG分析显示，这55个蛋白主要富集在糖酵解/糖异生途径，包括FBP1和ENO1。STEM分析得到的簇18含有12种蛋白质，包括白细胞介素18结合蛋白（IL-18BP），其在慢性HBV感染的不同阶段显示出最显著的不同。接下来，研究者使用ELISA做了进一步验证。与IC患者相比，ENH患者表达高水平的SOD2、IL-18BP和ENO1。尽管FBP1在ENH患者和IC患者之间没有显着差异，但在HBeAg阳性患者中有比HBeAg阴性患者和健康对照更高的FBP1。
本文，研究者对慢性HBV感染自然进程的患者血清进行了TMT蛋白质组学检测。随后，通过生物信息学分析筛选出差异蛋白（DEP）。最后，研究者通过酶联免疫吸附试验（ELISA）评估临床样本，验证了慢性HBV感染进程中的DEP。作者的结果提供了区分感染HBV不同阶段的潜在生物标志物，有助于开发新型生物标志物和治疗慢性HBV感染的靶标。
吉凯助力
本研究的TMT血清蛋白质组学由吉凯基因提供技术服务。
·蛋白质组学平台拥有多台timsTOF Pro、Exploris 480高精度质谱仪，专业的Spectronaut Plusar、Mascot等分析软件，提供专业的4D、DIA、TMT、PRM、磷酸化修饰组、olink蛋白质组等检测服务，强大的机器学习算法、IPA分析、蛋白基因组分析服务，系统的生物标志物、分子分型、药物靶点、基因功能研究等解决方案，真正让广大研究型医生的科研工作更省心、更省力、更高效；
·高通量测序平台分为常规测序服务和单细胞测序服务：单细胞测序拥有10x和BD两个平台，提供单细胞RNA-seq、单细胞核测序、单细胞混样RNA-seq、单细胞TCR/BCR、单细胞（RNA+ATAC）、空间转录组测序等服务；常规测序服务提供meRIP-seq（m6A/m1A/m7G/m5C 等RNA甲基化修饰测序）、acRIP-seq（ac4C RNA乙酰化修饰测序）、ATAC-seq、Ribo-seq（翻译组测序） 、mRNA/miRNA/LncRNA/circRNA-seq、全转录组测序（两文库/三文库）、外泌体miRNA/LncRNA-seq、WGS/WES、WGBS、RRBS、BSAS等服务