土壤DNA提取的解决专家

简介

土壤样品含有大量的微生物，其中绝大部分的微生物都是无法直接培养进行繁殖和研究。从土壤样品中提取DNA是研究土壤微生物最为有效的方法。目前从土壤样品中提取微生物DNA的方法主要有直接法和间接法。直接法是指把土壤样品放在裂解液中，经过有效的破壁方法使微生物的DNA全部释放到裂解液中，然后再进行分离提取，如Zhou的方法。间接法是指将土壤放在一种的缓冲液中，如Buffer PBS等，把微生物从土壤中分离出来，然后再进行DNA的提取。间接法可大大降低土壤中腐殖酸，重金属盐对DNA提取带来的影响，但是这种方法会丢失许多微生物，得到的DNA并非土壤样品中的全基因组(宏基因组)，目前已经很少研究者会采用这种方法。从土壤样品中直接提取DNA可最大可能性地获得全基因组，但是这种方法却面临以下几个问题：

1.         腐殖酸的污染。土壤中，特别是森林，草地土壤含有非常丰富的腐殖酸。腐殖酸是一系列的有机物分子，部分分腐殖酸同核酸分子非常类似，在纯化过程中非常难于去除。微量的腐殖酸污染都会导致下游应用，如PCR，酶切的失败。

2.         裂解方法。土壤样品中含有各种微生物，如细菌和真菌等。革兰氏阳性细菌和真菌都含有非常厚的细菌壁，让这些微生物的细胞壁有效破裂是提取高产量宏基因组DNA的关键。由于土壤样品的复杂性，使用酶法(如溶菌酶，破壁酶，蜗牛酶)或液氮研磨都不可行，因为土壤中含有各种金属离子或抑制因子导致消化酶的活性失活，或土壤中的沙粒等会导致液氮研磨很难进行。

3.         DNA得率难于控制。土壤样品或因肥沃，或因贫瘠，或因含水量丰富，或因干枯，或因取样的深浅度，都会造成微生物数量和品种发生剧烈改变。在一个小范围的土壤样品DNA含量往往会差别成千上百倍。此外，某些土壤中含有的化学成分，如重金属盐，粘土物质都会造成DNA得率降低。

Omega Biotek公司的E.Z.N.A. Soil DNA Kit是目前土壤DNA提取最为优化的试剂盒。该试剂盒采用玻璃珠研磨法和热激化学破壁法，可不需特殊的珠磨仪，在点动涡旋仪就可进行，适合于广大的研究室。试剂盒中HTR Reagent是Omega Biotek公司独家开发的腐殖酸吸附剂，能高效去除各种腐殖酸的污染。此外还采用无醇的硅胶柱纯化方式，可高效去除土壤中各种可溶性金属盐，以及其它可溶性的抑制因子。该试剂盒已经成功地提取如下土壤(部分是客户反馈)：自然保护区森林的土壤(长达30-40年森林土壤，表层有30-50cm落叶层)，红树林土壤，草地，耕地，海底泥，污泥，矿石区泥土，有机物污染的泥土，池塘泥，垃圾泥，空调管道堆积物等。

实验方法

为表明该试剂盒的优势性，我们选择以下不同组织样品进行DNA提取实验，每个样品重复3次。

l          森林类样品：自然保护区森林土壤(广东黑石顶自然保护区)和海南岛红树林保护区

l          矿石区样品：矿石区水底土壤(湿)和矿石区地表土壤(干)

l          耕地样品：稻田土壤，菜地土壤

l          有机物污染地表样品：污水沟衍泥和生活垃圾堆放区

操作方法（按Soil DNA Kit试剂盒进行）简单描述以下：

1.         取▲ 0.5g森林土壤/耕地土壤，或 ◆ 4g矿石区土壤和有机物污染土壤至15ml离心管中；

2.         加入▲ 0.5g酸洗玻璃珠，或 ◆ 4g酸洗玻璃珠；

3.         加入▲ 1ml Buffer SXL MLus，或 ◆ 8 ml Buffer SXL MLus；

4.         立即在涡旋仪上最高速涡旋3分钟。

5.         加入▲100ul  ，或◆ 800ul Buffer DS，涡旋15s混匀

6.         转移至预热至70^oC水浴锅中，水浴10-15分钟。

7.         3000 x g离心3分钟，转移▲800ul，或◆ 7 ml 上清，并加入▲270ul Buffer SP2或◆ 2.3 ml Buffer SP2，涡旋混匀；

8.         ▲ 10,000 x g离心5分钟，或 ◆ 5，000 x g离心10分钟；

9.         把上清液转称至新的2ml/15ml离心管中，加入0.7倍的异丙醇。(在处理矿石区样品时和有机物污染的样品中，还加入133ul糖原溶液)，涡旋混匀；

10.      ▲ 10,000 x g离心5分钟，或 ◆ 5，000 x g离心10分钟沉淀收集DNA。

11.      倒弃上清液，并反扣于吸水纸上5分钟；

12.      加入200 ul Elution Buffer，涡旋5秒。 65℃水浴20-60分钟，让DNA充分溶液。

13.      加入50ul HTR,反应2min后，离心，取上清。

14.      上清加入等体积（约200ul） XP2 Buffer，均匀后上柱。

15.      加入300ul XP2 Buffer，洗涤一次。

16.      加入700ul SPW Wash Buffer，洗涤两次。

17.      空甩后，加入适当量的Elution Buffer洗脱即可。

实验结果

1.       DNA电泳结果

取10 ul 纯化的基因组DNA上样于0.8%琼脂糖凝胶，80V电泳30分钟，结果如下。

0.5g森林类土壤样品

(前两个自然保护区森林土壤，后两个为红树林土壤)

0.5g耕地类土壤样品

A: 水稻田土壤

B: 玉米土壤

4g 有机物污染土壤样品

A: 生活垃圾堆放地

B: 污水沟底泥

4g 矿石泥

1和3是两个矿石区水底土壤(湿)

2和4矿石区地表土壤(干)

2.       DNA纯度和产量分析