实验准备——取材
| 组织来源 | 操作步骤 |
| 皮肤和粘膜 | 主要取皮片，面积一般2~4平方厘米。 |
| 血液细胞 | 一般多抽取静脉外周血或从淋巴组织中(如脾扁桃体、胸腺、淋巴结等)分离细胞取材时应注意抗凝。 |
| 鸡(鸭)鸟类胚胎组织 |
1.取孵化至适当杯龄(9~12天)的胚蛋，用照蛋灯在暗处灯检，若有丰富血管，胚体有运动的胚蛋，说明胚体发育良好，并用有色笔划出气室和胚体位置。 |
| 内脏和实体瘤 |
1.无菌环境。 |
| 骨暗、羊水、胸/腹水细胞 | 严格无菌，注意抗凝，还要尽快分离培养，离心后，用无钙、镁PBS洗两次，再用培养液洗一次后即可培养，不宜低温存放。 |
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动物组织取材: 鼠胚组织 |
1.用引颈或气管窒息致死法处死孕期合适的动物。 |
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动物组织取材: 幼鼠胚肾(或肺) |
幼鼠采用上述方法处死消毒后，腹部朝上固定在木板上先切开游离毛皮并拉开至两侧，采用无菌法打开胸腔取肺，或从背部打开腹腔取肾。 |
▨组织块培养法
1. 组织块接种后的前3天，在观察和移动的过程中，注意不要引起液体的振荡。要避免经常翻动和振动，否则组织块不易附着于瓶壁上或附着后也会脱落飘起。
2. 加入的培养液不宜过多，避免浸泡的组织块受轻微的波动而脱落下来。
3. 当细胞向外迁徙出来后要注意记录并去除漂浮的组织块和残留的细胞，它们产生的有毒物质会影响原代细胞的生长。
4. 为促进组织块尽快粘贴在培养瓶皿上，可以在种植前先将胶原薄层涂在培养瓶底壁上。
▨ 贴壁型原代细胞
1. 原代培养的分离细胞在初次接触体外环境时，它们之间会互相影响，在这些细胞之间能产生一些促生长的活性物质，使细胞彼此互相促进存活和生长。如果接种的细胞密度过低，细胞之间的促生长作用很小，也很难使细胞适应从体内的组织环境到被分散后进入独立生存环境的变化过程。如果接种的细胞密度过大，会导致营养物质供应不足，代谢废物积累较快需要经常换液和传代。
2. 适当增大原代培养接种的细胞密度，给培养的细胞提供更多的类似于在体内时细胞之间的相互作用，会极大提高原代培养的细胞在体外存活率。待细胞适应体外环境后进行传代培养时再以较低的密度接种和培养。
3. 尽快使接种的细胞贴壁，是决定培养能否成功的关键。可以在接种后先将培养瓶置培养箱内培养3h到5h，待细胞贴壁后，再补足培养液继续培养。
▨悬浮型原代细胞
1. 必须保持细胞的悬浮状态。可以通过增加培养液的黏度来帮助细胞呈悬浮状态，如给培养液中加入低浓度的透明质酸复合物。在有搅拌装置的培养器皿内加入培养液，以5ml为最低限度，否则搅拌时会产生气泡对细胞造成伤害。使用这种方式需注意勿使搅拌速度过快，否则即可使培养液溢出又容易造成污染。如果培养液的量在5ml以下，可以采用旋转瓶培养。给悬浮培养的细胞换液时要注意不要吸出细胞。
2. 能够进行悬浮培养的细胞，其生命力一般都比较旺盛，体外分裂增殖的速度较快，营养成分消耗大，换液时间隔一般较短。
原代细胞培养问题
▨ 原代细胞与细胞系有什么区别？
1.根据传统定义，自组织第一次收获和接种的细胞被称为原代细胞。这类细胞直接从组织分离，生命周期有限，经数次传代后会逐渐停止生长。原代细胞在有限的生命周期内需掌握好细胞的最大生长空间，以保持细胞群中基因型和表型的一致性。
细胞系是不断生长、分化的细胞群，因其经过遗传改造，致使其具有无限增长的潜能。体外生长的细胞系用于医疗或科研。
但实际上，经过长时间、连续的传代培养后，细胞系随着代数的增加，细胞的基因型和表型都有可能发生改变。
需要指出的是，在不同的科研小组中这些术语的定义会有所不同。许多研究员不用细胞系这个词表示细胞群，除非细胞经过了遗传改造。
2. 能够进行悬浮培养的细胞，其生命力一般都比较旺盛，体外分裂增殖的速度较快，营养成分消耗大，换液时间隔一般较短。
▨ 倍增和代数有什么区别？
倍增是培养物中细胞总数的翻倍，通常是指细胞指数或对数生长期。代数是指细胞群从培养瓶中移出，传代培养过程的次数，传代培养的目的，是使细胞处于低密度以刺激其进一步生长。
▨ 接收到的冻存细胞该如何处理？
收到包装箱后，立即将冻存细胞从干冰移入液氮中冻存。此过程尽量快，以避免升温。不要将细胞储存在-80℃，这样会对细胞造成不可挽回的伤害。
▨ 冻存的细胞该如何开始培养？
1. 将一管细胞从液氮罐中取出，注意保护手和眼睛。
2. 将冻存管快速的放入37℃水浴中，轻轻握住并旋转，直到管内物体完全融化。
3. 将冻存管立即从水浴中拿出，擦干，转入无菌环境。
4. 用70％的酒精冲洗冻存管，然后擦去多余酒精。
5. 打开盖子，注意手指不要碰到里面的螺纹（注意，由于冻存管有负压，开盖时可能会有少量溢出，这是正常现象）。
6. 用多聚赖氨酸（或参照说明书）包被培养瓶。多数细胞推荐的接种密度为每平方厘米5000个细胞。
7. 盖好培养瓶的盖子，轻轻摇晃培养瓶以使细胞分布均匀。若需要气体交换可打开盖子。
8. 将培养瓶放入培养箱中（37℃，5%CO2，95%空气）
9. 放入培养箱后第6-16小时更换一次培养基，以去除残留的二甲基亚砜和未贴壁的细胞。
▨ 细胞培养过程中，多久更换一次培养基？
这取决于细胞生长的速度。一般而言2-3天更换一次培养基，许多细胞培养实验室通常在周一，周三，周五更换培养基。
注意：冻存细胞复苏后，在6-16小时内更换培养基，以去除残留的二甲基亚砜和死亡的细胞。
▨我能扩增培养和再次冻存原代正常人类细胞吗？
这取决于细胞的类型。
一些细胞类型像神经细胞，神经胶质细胞和一些生长缓慢的上皮细胞，不推荐扩增培养和再次冻存。
其它的细胞类型像成纤维细胞、星形细胞、肾系膜细胞、星形胶质细胞等等，可以扩增培养和再次冻存。
然而，需要注意的是再次冻存的过程可能导致细胞生长性能的改变。
▨ 培养瓶中应该加入多少体积的培养基？
我们推荐的用量为：
Nest T-25培养瓶5mL
T-75培养瓶15mL
T-225培养瓶50mL
