CD127 VS Foxp3
虽然Foxp3是目前公认的调节性T细胞最特异的指标，但因其位于细胞内，使得Foxp3的染色必须要固定细胞并破核膜，因此这种方法并不适用于分离活的Tregs，且该方法比较传统，操作相对复杂，稍有不慎就会影响实验结果。
而CD127属于细胞表面Marker，无需固定破膜。因此，当前主流方向是通过CD127来检测人Tregs。
CD127的发现
CD127是2006年被发现的一种检测CD4+CD25+调节性T细胞的新指标。由于不需要将细胞固定破膜处理，检测起来要比Foxp3方便。
研究发现，CD4+CD25+纯化的细胞中，CD127与Foxp3的表达呈负相关。通过CD4+CD127low纯化出的CD4+CD25+ T细胞，与Foxp3纯化的CD4+CD25+ T细胞数量相似，并且这部分细胞展现了CD4+CD25+调节性T细胞的典型特征。CD4+CD25+CD127-/low是较CD4+CD25+Foxp3+更优的特异性检测
配色方案
|
细胞亚群 |
种属 |
指标 |
荧光标记 |
克隆号 |
|
Treg |
Human |
CD45 |
EV450 |
HI30 |
|
CD3 |
ER780 |
OKT3 |
||
|
CD4 |
FITC |
RPA-T4 |
||
|
CD8a |
PerCP/Cyanine5.5 |
OKT-8 |
||
|
CD25 |
PE |
BC96 |
||
|
CD127 |
AF647 |
A019D5 |
人Treg鉴定所需流式抗体
|
产品名称 |
荧光素 |
货号 |
规格 |
|
CD45 |
EV450 |
E-AB-F1137Q |
20T |
|
CD3 |
ER780 |
E-AB-F1001S |
20T |
|
CD4 |
FITC |
E-AB-F1109C |
20T |
|
CD8a |
PerCP/Cyanine5.5 |
E-AB-F1110J |
20T |
|
CD25 |
PE |
E-AB-F1194D |
20T |
|
CD127 |
AF647 |
E-AB-F1152M |
20T |
人Treg鉴定所需辅助试剂
|
作用 |
货号 |
名称 |
规格 |
|
细胞染色 缓冲液 |
E-CK-A107 |
Cell Staining Buffer |
100mL |
|
红细胞 裂解液 |
E-CK-A105 |
10×ACK Lysis Buffer |
100mL |
样本管设置
|
目的 |
样本 |
设置 |
|
调电压 |
1 |
Blank（空白管） |
|
调补偿 |
2 |
CD45-EV450 |
|
3 |
CD3-ER780 |
|
|
4 |
CD4-FITC |
|
|
5 |
CD8a-PerCP/Cyanine5.5 |
|
|
6 |
CD25-PE |
|
|
7 |
CD127-AF647 |
|
|
Full Panel |
8 |
CD45-EV450、CD3-ER780、CD4-FITC、CD8a-PerCP/Cyanine5.5、CD25-PE、CD127-AF647 |
实验步骤
01
在离心管内加入100μL新鲜血，与2mL 1×ACK红细胞裂解液混匀，4℃裂解10min；
02
300g离心5min（裂解完立即离心，防止时间过长损伤细胞），弃掉上清，用移液枪轻轻吸走残液，可以得到白色的细胞沉淀；
03
加入100μL细胞染色缓冲液，重悬细胞，与流式抗体混匀，4℃孵育30min；
04
加入2mL细胞染色缓冲液，300g离心5min，弃掉上清，再加入200μL细胞染色缓冲液，重悬细胞；
05
上机进行检测。
实验结果
人外周血Treg细胞表型分析
解析：
▶ 荧光素间有溢漏，故需要设置单阳管，用于调节补偿；
▶ 本实验取正常人外周血验证