胰腺癌是导致癌症死亡的主要疾病之一，且预计到2040年将成为第二大死因。尽管治疗手段有所进步，但胰腺癌的五年生存率仍然很低，因为大多数患者在诊断时已处于晚期。因此，需要深入了解胰腺癌的生物学特性以改善治疗效果。本研究通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）和空间转录组测序（ST -seq)分析胰腺癌组织，以揭示肿瘤微环境中的异质性。对17名胰腺肿瘤患者样本进行了深度测序。分析揭示了胰腺癌肿瘤微环境中的异质性，并发现了一个新的癌细胞亚群Ep_VGLL1，它具有介于经典型和基底样亚型之间的中间特征，可能代表了胰腺癌进展中的一个过渡状态。这一发现为胰腺癌的治疗提供了新的视角和潜在的治疗靶点。

scRNA-seq、ST -seq

1. 胰腺癌细胞和CAF的全面单细胞转录组图

为了解释癌细胞和CAF的异质性，研究人员对17名胰腺肿瘤患者（包括16名胰腺癌患者和1名带有高级别异型增生的胰腺导管内乳头状粘液性肿瘤，IPMN）的手术样本进行单细胞RNA测序，富集了CD45阴性细胞（图1A）。鉴定出了五种主要的细胞类型：上皮细胞、成纤维细胞、血旺细胞、内皮细胞和星状细胞（图1B）。随后，研究人员使用拷贝数变异推断工具来识别癌症细胞，并发现预测的恶性细胞位于上皮细胞群体中（图1C）。进一步对上皮细胞和成纤维细胞进行了亚群聚类，以便进一步进行特征描述。胰腺癌上皮细胞通过每个群特异性的marker基因注释成9个簇（图 1D）。研究人员特别关注KRAS基因G12位点的突变状态，发现Ep_FXYD2亚群中的细胞大多含有野生型KRAS序列，暗示这些细胞可能代表非癌性上皮细胞，是癌前导管样细胞。研究还识别出Ep_CDK1亚群为增殖的癌上皮细胞，具有明显的细胞周期标志物（图1D）。最终，分析确定了不包括癌前Ep_FXYD2亚群和循环Ep_CDK1亚群共六种癌细胞亚群，这些亚群在增殖上表现出差异，其中Ep_TRIM54、Ep_KRT6A和Ep_VGLL1在循环细胞群体中富集，表明它们相对更具增殖性（图1E）。同样对成纤维细胞进行聚类分析，得到了八个成纤维细胞亚群（图1F）。排除Fb_Base和Fb_CDK1亚群，确定了六个具有独特基因表达特征的胰腺癌相关成纤维细胞（CAF）亚群，包括三个已被充分描述的CAF群体：Fb_SFRP1（炎症性CAF，iCAF）、Fb_LRRC15（肌成纤维细胞性CAF，myCAF）和Fb_MSLN（抗原呈递CAF，apCAF）。

2. 基于群体的聚类揭示了胰腺癌的病理和分子亚型。

在确定了胰腺癌组织中癌细胞和CAF详细亚群后，接下来想知道是否可以根据这些单细胞群的组成对患者进行分层。研究发现，基于癌细胞和CAF亚群组成的不同，可以将患者分为三个明显的群，即hClust0-2。其中，hClust0群中富含IPMN相关的样本，而hClust1和hClust2群中晚期疾病状态的患者更为集中。每个患者群都与特定的癌细胞亚群显著相关：hClust0与Ep_MSMB亚群相关，hClust1与Ep_TRIM54亚群相关，而hClust2与Ep_KRT6A和Ep_VGLL1亚群相关。此外，还发现hClust0群的CAF亚群多样性较低，主要由Fb_COL9A1亚群主导。这些发现通过层次聚类分析（图2B、C）和临床数据对比得到了验证（图2D、E）。每个患者群都可以通过特定癌细胞亚群的显著富集来标记（图 2F）。并且通过比较与胰腺癌亚型相关的基因表达特征进一步表征了患者群体（图2G）。同时，也观察到hClust0群体中CAF亚群的特定分布，多样性低于其他的患者群（图2H、I）。

3. Ep_VGLL1：一种与不良预后相关的新型胰腺癌细胞群

接下来，使用公共数据评估癌症和CAF簇的预后价值。在所有上皮细胞和成纤维细胞亚群中，只有Ep_KRT6A和Ep_VGLL1的标志物具有预后意义，它们表示不良预后（图3A、B）。高Ep_KRT6A组的不良预后是可预测的，因为它具有基底样特征，与Ep_VGLL1组不同，Ep_VGLL1组没有显示任何先前定义的特征（图2G）。通路富集分析清楚地表明，与Ep_VGLL1相比，Ep_KRT6A表达更高水平的上皮-间充质转化（EMT）基因集（图3C）。此外，Ep_KRT6A评分与整个癌细胞的EMT评分呈明显正相关，与Ep_VGLL1评分无相关性（图3D）。最重要的是，PDAC组织的RNA原位杂交图像清楚地分离了表达VGLL1的细胞和表达KRT6B的细胞（图3E）。

4. 解读调控胰腺癌细胞簇的转录因子网络

为明确癌细胞簇的生物学特性，通过SCENIC分析各亚群中转录因子（TF）活性（图4A）。值得注意的是，推断出的TF活性被分为不同的群，这些群与上皮亚群有很好的相关性。接着，基于TF活性数据重建相关性TF网络（图4B），依上皮细胞群特性命名各组TF：Ep_MSMB对应“IPMN-associated”；Ep_TRIM54含高活性“classical”TF，Ep_KRT6A等含“basal-like”TF，二者对比鲜明；“EMT-related”TF群含关键调控因子，对Ep_KRT6A有高度特异性；还识别出Ep_VGLL1特异性TF，处于关键连接位置。最后，TF活性的扩散图与PCA投影显示，Ep_VGLL1对应的TF群位于“classical”和“basal-like”群中点，由此推测Ep_VGLL1代表过渡癌细胞群体，其特异性TF标注为“transitional”（图4C）。

5. Ep_VGLL1的分子特征表明其具有过渡特性

通过TF分析发现，Ep_VGLL1呈现出独特的SOX4与KLF5活性水平（图 5A）。进一步观察发现，Ep_VGLL1中SMAD4 平均表达量处于低位，与基底样群相当，这暗示它具备基底样特性；同时，该群中经典胰腺癌替代标志物GATA6表达量低，体现出其非经典性质，且已知GATA6与Wnt信号通路依赖相关，低表达也意味着 Ep_VGLL1 具有Wnt独立性（图 5B）。细胞间通讯分析结果显示，Ep_VGLL1 能够作为信号发送者参与 Wnt 信号通路（图 5C），利用过往报道的 Wnt 依赖基因特征进行分析，发现Ep_VGLL1 和其他基底样簇一样，有着明显的 Wnt 独立特征（图 5D）。由于KLF5 是维持多种细胞类型上皮细胞特性的关键要素，对Ep_VGLL1细胞身份的探究发现，它高表达紧密连接蛋白基因TJP1与OCLN，而间充质细胞标记物VIM、S100A4表达量低，这有别于其他基底样簇，表明其仍保留上皮细胞特性（图 5E）。近期有报道称，在FOLFIRINOX治疗下，胰腺癌肿瘤球体细胞会通过癌内在机制发生从经典型到基底样的转变。利用自身的亚群标志物追踪这一转变过程，结果显示Ep_TRIM54特征随时间逐渐减少，Ep_KRT6A 特征不断增加，而Ep_VGLL1特征在第4天达到峰值，随后逐渐下降，恰好位于Ep_KRT6A 激增之前（图 5F）。综合来看，这些结果揭示出Ep_VGLL1 群处于中间过渡状态，很可能代表着基底样与经典型癌细胞之间的过渡群体。

6. 空间转录组数据揭示人类胰腺癌中癌症亚群和相关微环境的动态

研究人员利用癌细胞和CAF亚群的详细参考图谱来探究人类胰腺癌的空间复杂性。从scRNA-seq队列中生成了7对空间转录组数据，并使用贝叶斯推断模型对这些数据进行分析，以识别不同细胞类型和亚群的空间分布模式（图6A）。随后，比较了scRNA数据和配对空间转录组数据中癌细胞和成纤维细胞亚群 (图6B-C) 的组成。结果发现，空间转录组数据中的癌细胞亚群组成与单细胞数据中的癌细胞组成高度一致 (图 6D)，而成纤维细胞组成则不同 (图6E-F)。

7. 胰腺癌中癌细胞亚群与肿瘤微环境的空间关联性研究

在这项研究中，研究人员还关注胰腺癌中基质细胞和免疫细胞的分布以及它们与癌细胞亚群的空间相关性。通过邻接网络图，区分了靠近和不靠近癌细胞的细胞类型（图7A-C）。还发现，肌成纤维细胞CAF群的代表Fb_LRRC15在空间分布上与胰腺癌细胞高度相关（图7D），而炎症成纤维细胞iCAF的代表Fb_SFRP1则位于远离癌症区域的位置（图7E）。值得注意的是，主要的癌细胞亚群Ep_TRIM54、Ep_VGLL1和Ep_KRT6A均未显示出对Fb_LRRC15的偏好（图7D）。这一点与单细胞RNA测序数据一致，即这些癌细胞亚群单独与Fb_LRRC15无相关性，但它们的总和与Fb_LRRC15的比例高度相关（图7F）。

本研究通过单细胞转录组和空间转录组，对胰腺癌肿瘤微环境中的上皮细胞和成纤维细胞进行了全面分析。鉴定了五种不同的功能性胰腺癌细胞亚群和六种不同的癌相关成纤维细胞亚群。在这些亚群中，识别了一个新型的癌细胞亚群Ep_VGLL1，它显示出介于基底样和经典亚型之间的中间特征，这一点得到了空间转录组数据的支持。这种综合性分析不仅提供了胰腺癌和成纤维细胞群体的全面景观，还为胰腺癌细胞的动态状态提供了新的见解，并揭示了潜在的治疗靶点。

参考文献：

Kim S, Leem G, Choi J, et al. Integrative analysis of spatial and single-cell transcriptome data from human pancreatic cancer reveals an intermediate cancer cell population associated with poor prognosis. Genome Med. 2024 Jan 31;16(1):20. doi: 10.1186/s13073-024-01287-7. PMID: 38297291; PMCID: PMC10832111.